苦参碱下调肝卵圆细胞Notch信号通路阻断肝癌前病变的实验研究

肝癌前病变中大量卵圆细胞增生。肝卵圆细胞是肝干细胞,可向肝细胞、胆管上皮细胞或肝癌细胞方向分化。Notch信号途径是调节细胞定向分化的一条极其重要的信号，调节几乎所有组织和器官包括肿瘤细胞的发生发育。苦参碱是一种较好的诱导分化剂，能诱导卵圆细胞向肝细胞分化，机制与下调Notch信号有关。本课题先建立肝卵圆细胞增殖的大鼠肝癌前病变模型，分离鉴定卵圆细胞，构建siRNA的Notch1大鼠肝卵圆细胞系，观察下调Notch1后苦参碱对卵圆细胞的诱导分化作用，最后将RNA干扰Notch1的卵圆细胞移植大鼠肝癌前病变模型，同时给与苦参碱灌胃，观察卵圆细胞的成瘤性，探讨苦参碱对卵圆细胞下调Notch信号通路后的促分化作用及相关机制，为苦参碱是否可作为肝癌前病变的诱导分化剂提供理论依据，为基因修饰干细胞移植治疗肝癌提供实验依据,为中西医结合阻断肝癌前病变提供新的途径。

一、已成功完成Solt-Farber法建立的大鼠肝卵圆细胞增殖的肝癌前病变模型。经过3次实验，两步胶原酶灌注法及Percoll密度梯度离心法分离大鼠肝卵圆细胞并鉴定、培养。已能成功分离原代大鼠肝卵圆细胞，但细胞数目较少，传2代细胞就死掉。因此改用大鼠肝卵圆细胞系WBF344做后续实验。.二、细胞内源靶基因表达水平检测：通过qPCR方法检测目的基因表达及靶细胞转染条件优化.三、 靶细胞转染效率优化：通过转染阴性对照质粒GFP的方法检测靶细胞WBF344的荧光表达情况，确定该细胞的最佳转染比例 。GFP质粒（pCDNA6.2-GW/EmGFP-nega）转染WBF344细胞的转染效率达20%；随着lipofectamine 2000转染比例的增加，转染效率可明显的提高。.四、 苦参碱含药血清对Notch1特异性siRNA大鼠肝卵圆细胞向肝细胞的诱导分化作用：（一）、苦参碱含药血清的制备（二）实验分组及处理.苦参碱含药血清分别培养oval-ICN1、oval-pc、oval细胞，实验分A、B、C三组：A组为终浓度为20%的苦参碱含药血清组；B组为终浓度为10%的苦参碱含药血清组；C组为正常RPMI-1640培养液组。.（三）检测指标 1、MTT法筛选最佳苦参碱含药血清浓度为20%。2、第三、四部分卵圆细胞检测细胞周期、免疫细胞化学、Western-blot、RT-PCR正在进行中。.五、免疫组化法检测126例肝癌患者、44例癌旁硬化肝组织、10例肝血管瘤旁肝组织卵圆细胞调节基因的蛋白表达：Notch信号通路（ Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1）、Wnt/β-catenin信号通路、HNF-1α、HNF-4α、HNF-3β及SALL4，并进行5年生存分析。.二、存在问题及解决方法.1、已能成功分离原代大鼠肝卵圆细胞，但细胞数目较少，传2代细胞就死掉。因此改用大鼠肝卵圆细胞系WBF344做后续实验。.2、GFP质粒（pCDNA6.2-GW/EmGFP-nega）转染WBF344细胞的转染效率达20%；随着lipofectamine 2000转染比例的增加，转染效率有待进一步提高。.3、由于本人2013年初患甲状腺癌行手术及放疗，未完成实验。现正在进行实验。