NLRX1在毛细胞损伤致感音性耳聋中的作用机制

Poor hair cell function is well recognized as a determinant attributable to sensory hearing loss. It has been documented that, NLRX1, a kind of pattern recognition receptors, is closely associated with ROS production, mitochondrial damage, inflammation regulation, and cell apoptosis. Previously, we found that NLRX1 was highly expressed in hair cell line HEI-OC1 and cochlear hair cells of murine inner ear and, also, that JNK signaling pathway was activated and apoptosis-related proteins were highly expressed when NLRX1 was overexpressed. However, the precise mechanisms underlying the action of NLRX1 in the process of hair cell damage are largely unrevealed to date. Based on the previous study, the present project was designed, using the wild type and NLRX1-knockout mice as well as hair cell line HEI-OC1 as experimental materials, to further investigate that: 1) whether NLRX1 can up-regulate the mitochondrial ROS level that further activates the JNK pathway; 2) whether the NLRX1-regulted ROS is able to elicit the apoptosis of hair cell via the activation of JNK pathway; and 3) whether the regulation of the NLRX1 expression level can control the activation of JNK pathway, whereby rescues hair cell apoptosis under the insult conditionl. This will be helpful for elucidating the mechanism underlying the pathogenesis of hair cell damage, which might, in turn, provide a promising therapeutic target for the sensory hearing loss.

毛细胞功能障碍是感音性耳聋病理进展的关键因素。研究表明，线粒体功能调控蛋白NLRX1与ROS生成、线粒体损伤、免疫炎症调节及细胞凋亡密切相关。我们前期研究发现，NLRX1在HEI-OC1毛细胞系及小鼠耳蜗毛细胞内表达，并且NLRX1过表达时，细胞JNK信号通路被激活，凋亡因子表达水平升高。但迄今为止，NLRX1在毛细胞损伤过程中的作用机制尚不清楚。本项目在前期研究基础上，拟以野生型小鼠、NLRX1基因敲除小鼠及HEI-OC1毛细胞系为实验材料，进一步研究：1）NLRX1是否上调线粒体ROS水平进而激活JNK信号通路；2）NLRX1调控的ROS是否通过影响JNK信号通路的活性介导毛细胞凋亡；3）是否可以通过调节毛细胞NLRX1的表达水平，实现调控应激状态时毛细胞JNK信号通路的活性来挽救毛细胞凋亡。本研究将助于毛细胞损伤的病理机制研究，提供新的理论依据，为感音性耳聋的治疗提供新的作用靶点。

听觉损失是主要以毛细胞损害为病理基础的最常见的感官缺陷疾病之一, 给个人、家庭和社会带来极大负担。基于前期实验数据，我们提出含核苷酸结合结构域和富亮氨酸重复序列的蛋白家族成员, NLRX1，可能参与耳蜗毛细胞损伤过程，有望成为防治感音性耳聋的新靶点。.本课题的主要内容和研究结果如下：1）我们首次发现， NLRX1在野生型的C57BL/6小鼠耳蜗毛细胞内表达。NLRX1的表达水平随着小鼠发育成熟及听力形成而表达增加；而随着小鼠衰老听力受损而表达下降。这表明NLRX1在C57BL/6小鼠耳蜗毛细胞内表达并可能与听力的形成和维持有关，为将NLRX1的功能及机制研究扩展到了耳科学领域奠定了坚实的实验基础。2）在新霉素处理的3月龄小鼠耳蜗毛细胞内，检测到凋亡信号JNK的激活及NLRX1的表达升高。这表明NLRX1可能通过JNK通路参与新霉素诱导毛细胞凋亡，促进感音性聋的发生。3）顺铂对HEI-OC1细胞毒性作用，主要通过启动凋亡途径来实现；顺铂增加HEI-OC1细胞NLRX1表达，激活线粒体凋亡途径，促进HEI-OC1细胞凋亡；NLRX1沉默下调顺铂引起的ROS产生及 JNK信号激活；NLRX1过表达上调顺铂引起的ROS产生及 JNK信号激活。顺铂刺激下小鼠耳蜗基底膜毛细胞明显损伤，NLRX1表达增加，ROS/JNK信号及线粒体途径细胞凋亡信号激活。本研究首次在HEI-OC1听细胞揭示了NLRX1通过激活ROS/JNK信号启动内源性细胞凋亡途径，增加顺铂对内耳听细胞的毒性作用，阐明了NLRX1在顺铂耳毒性发生中的重要调控作用。4）本研究发现，顺铂促进HEI-OC1细胞LC3-Ⅱ及NLRX1表达并呈现浓度依赖性，与NLRX1表达成正相关，而与细胞活力成负相；NLRX1过表达促进HEI-OC1细胞中自噬小体聚集；NLRX1沉默减弱顺铂诱导的自噬小体聚集及细胞毒性，NLRX1过表达促进顺铂诱导的自噬小体聚集及加剧顺铂细胞毒性；顺铂促进体外培养耳蜗基底膜中NLRX1表达及ROS产生，抑制 ROS减弱顺铂引起的毛细胞损伤；抑制ROS明显减弱顺铂处理的基底膜中的细胞自噬和细胞凋亡。本研究表明，NLRX1可能通过促进顺铂引起自噬性死亡，加剧耳毒性，为拓宽对药物引起的毒性机制的认识提供了新的基础。