肾脏内源性Mas受体活化通过RNF25调控TGFβRII/Smad3泛素化在肾间质纤维化中的作用研究

Renal endogenous RAS has attracted scientific attention in the regulation of Renal interstitial fibrosis (RIF). However, the role of renal endogenous MasR activation in the RIF remains unclear. Our previous results showed that after silencing MasR in renal proximal tubule (RPT) cells, both TGFβRII expression and TGFβ-mediated epithelial to mesenchymal transition (EMT) are increased, indicating that endogenous MasR activation may play an important role in inhibiting RIF. Moreover, we screened ubiquitination enzymes by siRNA library. RNF25 attracted our attention in the screening results. We found that RNF25 locates downstream of MasR; inhibits TGFβRII- or Smad3-induced TGFβ signaling; coimmunoprecipitates with TGFβRII or Smad3, suggesting that RNF25 may mediate the inhibitory effects of endogenous MasR activation in RIF. Thus, we will perform experiments in renal MasR conditional KO mice to confirm the role of endogenous MasR activation in RIF in the present study; observe the cell phenotype change after silencing MasR in human RPT cells or primary RPT cells from MasR-/- mice; explore the pathway that via RNF25, endogenous MasR activation promotes the ubiquitination of TGFβRII and Smad3. These results may highlight potential strategies for the prevention and treatment of RIF.

肾脏内源性RAS在RIF中受到重视，但内源性MasR活化与RIF关系仍未明确。我们前期发现沉默近曲小管细胞（RPT）MasR后，TGFβRII表达升高，TGFβ促上皮细胞间充质转分化（EMT）增强，提示内源性MasR活化可能在抑制RIF中扮演了重要角色。而且，我们前期预实验还通过siRNA库筛选出泛素化酶RNF25，并确定其位于MasR下游；发现RNF25可抑制TGFβRII或Smad3诱发的TGFβ信号，且与两者均存在内源性相互作用，提示RNF25可能介导了内源性MasR活化对TGFβ促RIF的抑制效应。因此，本课题在前期研究工作基础上，以肾脏条件Mas-/-小鼠为研究对象，确证MasR敲除对RIF发生的作用；在Mas-/-小鼠原代和人RPT细胞中观察沉默MasR后EMT等改变；明确内源性MasR激活通过RNF25促TGFβRII及Smad3泛素化降解途径，为RIF防护提供重要依据。

肾小管上皮细胞间充质转分化（EMT）是肾间质纤维化的主要原因。转化生长因子-β（TGF-β）是作用最强的促EMT因子。血管紧张素转换酶2(ACE2)-血管紧张素1-7[Ang-(1-7)]-Mas受体组成的“非经典肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system, RAS）”轴在肾脏具有重要作用。外源性Ang-(1-7)与肾脏Mas受体结合后，发挥促尿钠排泄、抗炎等效应。但是肾脏内源性Mas受体激活在肾间质纤维化中的作用仍不明确。本研究以人肾脏近曲小管上皮细胞（RPT）为研究对象，发现：1. 沉默Mas受体后，对RPT细胞间EMT起关键作用的TGF-β受体（TGF-βRII）表达明显增加；2. 随着Mas受体表达敲低，TGF-β介导的促RPT细胞EMT显著增强，EMT标记物表达明显变化，提示内源性Mas受体导致的TGF-βRII表达变化可影响TGF-β介导的肾脏纤维化；3. Mas受体与TGF-βRII在人RPT细胞中存在空间共定位，进一步利用免疫共沉淀技术发现Mas受体与TGF-βRII在RPT细胞具有直接物理关联，且该直接联系在短时间（30 分钟）刺激后明显增强，提示Mas受体和TGF-βRII之间具有直接的相互作用；4. 在RPT细胞中沉默Mas受体后，环指蛋白25（RNF25）表达明显降低，并且发现RNF25过表达可有效削弱TGF-βRII或TGF-β受体下游通路关键分子Smad3诱导的TGF-β信号上调，提示MAS受体可能通过调节RNF25进而影响TGF-β诱导的促RPT细胞EMT效应。本课题结果将有利于阐明肾脏内源性Mas受体激活在肾间质纤维化病变进程中的重要作用，为肾间质纤维化的发病和防护研究提供重要依据。