Nrf2信号通路在原花青素影响砷甲基化代谢中的作用研究

Procyanidin protects the arsenic-induced liver damage by the antioxidative stress. Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2) signal pathway plays a crucial role in the process of antioxidative stress in body. So far, we haven’t found any studies in the literatures about the influence of procyanidin on the arsenic methylation and its interaction with Nrf2 signal pathway. Firstly we treat L02 cell line with sodium arsenite (NaAsO2) and different doses of grape seed procyanidin extract (GSPE). The L02 cell line will be divided into normal, Nrf2 knockingout and Nrf2 activation groups by plasmid transfection. Secondly we carry out similar experiment design on the normal and Nrf2 konckingout mice treated with NaAsO2 and GSPE. The concentration of arsenic metabolic products, indexes of the liver function and oxidative stress will be detected by ICP-MS and ELISA kits. The change of cell and liver tissue morphology and the expression level of mRNA and protein of the key downstream genes of Nrf2 signal pathway (including nqo1, ho-1, gslm, gsto and nrf2) are to be detected by using the techniques of HE staining, IHC, Real Time PCR and Western Blot. The objectives of this study are to evaluate the influence of GSPE on arsenic methylation and to reveal the role of Nrf2 signal pathway in the process, so as to provide the theoretical evidence for the prevention and treatment of arsenicosis and for the development and utilization of the rich grape resource in Xinjiang.

原花青素通过抗氧化作用拮抗砷肝脏毒性。核转录相关因子2（Nrf2）信号通路在机体抗氧化损伤中发挥了重要作用。关于原花青素对砷甲基化代谢的影响及Nrf2通路在其中的作用未见报道。本研究先以L02细胞为对象,应用质粒转染技术敲除Nrf2基因,施以亚砷酸钠染毒和低中高剂量葡萄籽原花青素干预;再对正常与Nrf2敲除小鼠开展亚砷酸钠及原花青素干预实验,利用ICP-MS及ELISA试剂盒检测砷代谢产物含量、肝功能及氧化应激指标;应用HE染色、IHC、RealTimePCR、WesternBlot等技术,观察细胞和组织形态与Nrf2调控的下游关键基因（醌氧化还原酶1、血红素单加氧酶-1、谷氨酸半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽-S-转移酶、Nrf2）mRNA和蛋白表达,阐明原花青素影响砷甲基化代谢的效果及Nrf2信号通路在其中的作用，为地方性砷中毒的防治提供理论依据，为开发和利用新疆葡萄资源提供参考。

砷是自然界广泛存在的非金属元素，由于摄入过量砷的饮水引起人群中出现砷中毒流行。目前砷中毒已成为公共卫生领域的研究热点问题。砷诱导氧化应激被认为是砷诱导毒性损伤的重要机制之一。葡萄籽原花青素（GSPE）具有较强的抗氧化作用，核转录相关因子2（Nuclear factor E2-relate factor，Nrf2）信号通路在机体抗氧化损伤中发挥了重要作用。关于GSPE对As甲基化代谢的影响及Nrf2通路在其中的作用未见报道。本研究通过体内和体外实验给予GSPE和As干预，结合Nrf2信号通路抑制剂干预分析Nrf2信号通路在原花青素拮抗砷毒性及影响砷甲基化过程中的作用。研究发现，As可以促进肝L-02细胞活性降低、变性、凋亡，此外As还可以造成肝L-02细胞氧化还原体系失衡，造成肝功能损伤。而GSPE具有较强的抗氧化作用，可以促进肝L-02的抗氧化酶的高表达，进而拮抗了砷诱导的氧化损伤，拮抗了砷诱导的肝L-02细胞凋亡作用，而且GSPE的拮抗作用具有一定剂量-效应关系。As通过下调Nrf2信号通路的表达，使NQO1、HO-1、GST表达水平降低，氧化损伤指标MDA升高，抗氧化指标SOD、GSH降低，诱导肝L-02细胞凋亡,进而促使肝功能指标ALT、AST升高。给予GSPE干预后，可以激活Nrf2信号通路，上调NQO1、HO-1、GST mRNA和蛋白表达水平，促进SOD、GSH水平发挥了抗氧化作用，进而拮抗了砷诱导的肝功能损伤作用。砷甲基化水平随As剂量的增加而增加；随着As剂量的增加，氧化损伤程度明显加重。As甲基化水平与肝氧化损伤程度、肝功能损伤程度呈正相关关系。As染毒的L-02细胞会通过甲基化代谢过程产生iAs5+、iAs3+、MMA、DMA等甲基化代谢产物。砷的甲基化过程与细胞氧化损伤有关。而GSPE可以通过激活Nrf2信号通路提高L-02细胞的GSH水平，间接促进As甲基化代谢，使无机砷含量降低，甲基化砷DMA含量增加。本研究揭示了Nrf2信号通路在原花青素拮抗砷诱导肝功能损伤和影响砷甲基化中的作用，为完善原花青素的抗氧化机制提供理论依据。另外，本研究对于开发和利用新疆葡萄资源具有重要的推动作用，为防治地方性砷中毒具有重要的实用价值。