古细菌CCC1家族铁/锰离子跨膜转运蛋白的结构生物学研究

CCC1 family contains membrane proteins that transport iron or manganese ions across the membrane. They usually have 250-400 residues and 5 transmembrane helices. No high resolution protein structures have been determined for this family so far..We plan to study the 3D structure of archaea CCC1 family iron transporters and elucidate the iron transporting mechanism. .In this study, the recombinant target protein will be expressed in E. coli, purified with nickel affinity, gel filtration and other chromatography methods. Crystal screening will be performed against a variety of commercial screening kits. During initial crystal screening, the conventional low detergent and lipid concentration method aiming for type II membrane protein crystals will be used, as well as the newly developed HiLiDe method using high lipid and detergent concentration for type I membrane protein crystal growth, and the LCP (Lipid Cubic Phase) method which is also for type I membrane protein crystal growth..Once the initial crystals are obtained, crystal optimization on detergents, pH, precipitant and ion type and concentration will be performed. The crystal diffraction ability will be tested and diffraction data will be collected at synchrotron. Meanwhile, heavy metal soaking and Se-Met derivate crystals will be used for phasing and structure determination. The iron transporting mechanism will be proposed based on structure analysis and validated by biochemical activity studies.

CCC1家族蛋白是一类跨膜转运铁或锰离子的膜蛋白。该家族蛋白通常有250-400个氨基酸，5次跨膜螺旋。目前国际上尚未解析此家族蛋白的高分辨率结构。.本研究计划解析古细菌CCC1家族铁离子转运蛋白的高分辨率三维结构，阐明铁离子跨膜转运的机理。.研究内容包括用大肠杆菌异源表达目的蛋白，用镍柱亲和、凝胶阻滞等层析方法纯化蛋白，再用多种商业化结晶试剂盒筛选晶体。晶体初筛时会使用传统的低去垢剂浓度低脂质浓度的二型膜蛋白晶体生长法，最新发展的高去垢剂浓度高脂质浓度的HiLiDe一型膜蛋白晶体生长法以及LCP脂立方相膜蛋白晶体生长方法。.获得初始晶体后，对去垢剂、pH值、沉淀剂及盐浓度等进行精细优化以得到最优晶体，在同步辐射光源测试晶体衍射能力，收集衍射数据。同时，通过浸泡重金属化合物和硒代甲硫氨酸修饰目的蛋白的方法获取相位信息进而解析结构。基于结构分析和活性实验结果，使铁离子跨膜转运的机理得到阐明。

过渡金属元素如铁、铜、锌、钴等是维持人体健康所必须的微量元素。一方面这类元素作为金属酶的组成部分结合在蛋白质上直接参与生命过程，另一方面过量的过渡金属元素具有生物毒性。因此生物体需要严格的调控细胞内金属元素的浓度。CCC1家族蛋白是一类跨膜转运铁离子或锰离子的膜蛋白，以次级转运的方式调控胞内的铁离子浓度，通常具有200-350个氨基酸，N端具有类铁蛋白结构域(ferritin-like domain), C端具有五次跨膜螺旋。其高分辨率三维结构尙未被解析，铁离子跨膜转运机理也不明了。.本课题克隆了嗜酸热硫化叶菌CCC1家族铁离子转运蛋白，并成功在大肠杆菌中异源表达了目的蛋白。通过优化去垢剂条件、优化纯化策略等步骤，得到了高纯度的目的蛋白。纯化后的蛋白被用于晶体筛选。在尝试了多种不同的去垢剂，包括β-OG，β-DDM，LDAO，DM，C12E8，MNG等去垢剂之后，在DM作为主要去垢剂的条件下获得了蛋白质晶体。在晶体筛选过程中，我们发现大肠杆菌的HFQ蛋白，即便在含量低于5% 的情况下，也能长出杂蛋白晶体，该发现对于其他从事结构生物学研究的人具有借鉴意义。.晶体优化过程并不顺利。尽管在优化过程中我们对结晶条件，包括盐、沉淀剂、缓冲液做了细致系统的优化，也尝试了不同的去垢剂、脂质添加剂，而且对蛋白本身进行了点突变等修饰，最后拿到晶体的衍射能力始终无法超过6埃。.考虑到目的蛋白的N端类铁蛋白结构域本身也能提供铁离子被富集再被转运的信息。在本课题中我们也尝试了只结晶N端结构域。在测试不同表达片段后，我们成功表达并纯化了N端片段。该片段长出了针簇状晶体。不过晶体衍射能力非常弱。.在本课题研究过程中，我们成功获得了目的蛋白的晶体，这是通往成功地一大突破。课题在获得高分辨率衍射数据的这一步受到了阻碍。尽管付出了大量的工作，晶体分辨率始终无法突破6埃。这是膜蛋白晶体学研究中常遇到的问题。虽然本课题没有获得CCC1蛋白的精细三维结构，但是鉴定出初始结晶条件为今后同领域的研究指出了方向。