基于RNA-seq技术的苜蓿根蘖性状发生分子机制研究

Creeping-rooted trait in alfalfa was the character originate in yellow flower alfalfa which can generate shoots from the root system,and provide the plants with a rhizome-like ability to regenerate in stands.This habit of spreading by means of root proliferation provides alfalfa with a form of vegetative spread and multiplication，which has important significance to improving the ability of winter hardness,drought and grazing tolerance.To study expression of genes responsive to the creeping-rooted character,RNA-seq was used in this research to identify differentially expressed genes between the creeping-rooted plants and non-creeping-rooted plants with the same genotype. Constructing the transcriptomic library and using sequence analysis by the Illumina HiSeq? 2000，through the GO and DEG analysis,the associated genes will be sepreted .Finally,the vectors of over expression and RNAi expression were be constructed and the transferred to Arabidopsis to identify the gene function.The research will be make the molecular mechanism of creeping-rootedness of alfalfa clear, and isolating the associated gene,which provides the base for the discovering and identification of functional gene breeding of new alfalfa cultivater.

苜蓿根蘖性状是一种起源于黄花苜蓿的优异特性，根蘖型苜蓿具有抗寒、抗旱、耐牧的特点，是干旱半干旱草原区生态建设的优良类型。本研究针对国内外根蘖性状发生分子调控机制研究的空白，在根蘖型苜蓿新品系选育的研究基础上，采用相同遗传背景的根蘖与非根蘖苜蓿无性系为试验材料，通过根蘖性状形态发生过程中内源激素动态研究，确定取样的关键时期与组织部位，构建具有时空代表性的根蘖苜蓿转录组文库，利用RNA-seq高通量测序技术对转录组进行测序，通过差异基因表达与功能显著性富集（GO）分析，筛选出根蘖性状发生的相关基因，明确其序列特征分析与功能定位。通过本项目的实施，可阐明根蘖性状发育过程与形态建成内在机制的科学问题，探明根蘖特性与抗逆性之间的内在关系，获得根蘖性状发生相关基因的序列特征和功能定位，挖掘出优异功能基因资源，拓展根蘖苜蓿育种的技术手段。

苜蓿根蘖性状是一种起源于黄花苜蓿的优异特性，根蘖型苜蓿具有抗寒、抗旱、耐牧的特点，是干旱半干旱草原区生态建设的优良类型。本研究针对国内外根蘖性状发生分子调控机制研究的空白，试验材料选用3年生“BL-101”根蘖型苜蓿新品系，于根糵性状表达最明显的返青期进行取样。分别挖取5株表现出根蘖性状植株的根蘖芽和根蘖节之间部分与未表现根蘖性状的植株的水平根，进行混合取样分别提取总RNA，利用磁珠法分离mRNA后通过PCR扩增构建RNA-Seq转录组文库，利用RNA-seq高通量测序技术对转录组进行测序，通过差异基因表达与功能显著性富集（GO）分析，得到差异表达基因15 978条，通过生物过程分类，筛选出与根系相关的基因为5个。其中2个基因为与根蘖性状相关的表达上调基因，分别为（1）RAV基因，RAV基因是植物特有的一种转录因子，属于AP2 /EREBP基因家族中的亚族。其生物学功能主要与植物调控组织的发育以及耐胁迫性相关；（2）铁转运蛋白受体的AMP1基因，该基因在拟南芥中改变植物分生组织程序的基因。与根蘖芽分生组织形成有关。差异表达上调的基因分别为：（1）Snaking-1基因，该属于GASA基因家族，GASA基因家族的大部分成员受赤霉素调控；（2）Trx—硫氧还蛋白基因；（3）Phi_1基因，即磷酸诱导基因，有研究表明其过量表达对转Phi_1基因拟南芥的初生根和下胚轴伸长有促进作用。表达下调与根系发生相关的基因5个，经生物学信息分析确定其中2个属于Lon蛋白酶家族，其余分别属于植物肌动蛋白酶家族、硫氧还蛋白和脂氧合酶。研究探明了苜蓿根蘖性状发生过程的分子机制。苜蓿根蘖性状的发生首先依靠信号转导的激素响应蛋白基因、钙信号响应蛋白基因及蛋白激酶基因，与根系生长发育相关的表达基因则主要是赤霉素响应蛋白类基因和泛素连接酶类基因。AP2/EREBP转录因子与根蘖性状的发生相关，RAV基因很可能参与根蘖性状的发生，并且受赤霉素GA3的诱导与其他蛋白相结合控制根蘖性状的表达。此外，研究还揭示了根蘖特性与抗逆性状相关的分子机制：其中差异表达上调基因AP2/ERE其与植物抗逆性相关，DEAD-box基因、PRK基因和泛素蛋白连接酶，以及下调基因肌动蛋白酶家族，硫氧还蛋白和脂氧合酶，均与植物抗逆性相关。