基于转录组测序技术筛选高加索三叶草根蘖性状相关基因的研究

Caucasian Clover (Trifolium ambiguum Bieb.) is an only kind of perennial grass with creeping-rooted character which belongs to the Leguminous Trifolium. Comparing with other grasses within this Genus, winter hardness, drought and grazing tolerance of Caucasian Clover were observed due to its strong creeping-rooted character. This study aimed at the creeping-rooted traits closely related to their resistance to stress.In this study, the creeping-rooted trait closely related to their resistance to stress were studied in the early stage, based on the research on the morphogenesis and regulation of endogenous hormones, the key period of sampling and tissue location, and the construction of space-time-related Caucasian clover The creeping-rooted transcriptome library was sequenced by RNA-seq second generation and PacBio third-generation transcriptome. The differential expression genes were analyzed by bioinformatics method, and the related genes that regulate the formation of the creeping-rooted trait were screened out. The qRT-PCR analysis of the target gene Specific differences in expression, clear sequence features and functional positioning. Through the implementation of this project, we screened the excellent functional gene resources that regulate the creeping-rooted traits of Caucasian clover, laid the foundation for the study on the molecular regulation mechanism of the creeping-rooted trait in the Clover Caucasus. At the same time, It is of great significance to polymerize fine traits such as good quality and resistance to stress and to expand the application of clover in China.

高加索三叶草（Trifolium ambiguum Bieb.）是豆科三叶草属中唯一具有地下根蘖的多年生牧草，具有发达的地下根蘖，与同属的其它植物相比，具有较强的抗寒、抗旱和耐牧性。本研究针对与其抗逆性密切相关的根蘖性状，在前期根蘖性状形态发生和内源激素调节机制的研究基础上，确定取样的关键时期与组织部位，构建具有时空代表性的高加索三叶草根蘖转录组文库，联合利用RNA-seq二代和PacBio三代转录组测序，应用生物信息学方法分析差异表达基因，筛选出调控根蘖性状形成的相关基因，采用qRT-PCR技术分析目的基因的差异表达，明确其序列特征与功能定位。通过本项目的实施，筛选出调控高加索三叶草根蘖性状的优异功能基因资源，为研究高加索三叶草根蘖性状形成的分子调控机制奠定基础，同时对培育根蘖型牧草和草坪新品种，实现高产、优质和抗逆等优良性状的聚合，扩大三叶草属植物在我国的应用具有重要意义。

高加索三叶草（Trifolium ambiguum Bieb.）是豆科三叶草属中唯一具有地下根蘖的多年生牧草，具有极为重要的饲用、生态和育种价值。本项目在前期研究工作的基础上，针对与抗逆性密切相关的根蘖性状，联合利用RNA-seq和PacBio高通量测序技术对转录组进行测序，通过差异基因表达与功能显著性富集分析，筛选出调控高加索三叶草根蘖性状的优异功能基因资源，为研究植物根蘖性状形成的分子调控机制奠定基础。主要研究结果如下：.对根系的主根（T1）、水平根（T2）、根部膨大（T3）、根蘖芽（T4）和根蘖芽尖（T5）五个组织进行研究，总共获得了 19.82 GB 的干净数据和 80,654分析了非冗余转录本。通过与NR数据库对比，65.23%（50,689）的转录本序列与蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）序列一致，同源性最高。在KEGG数据库中总共注释到33,383（42.84%）条转录本，并进一步分类到128个途径中，其中“氨基酸的生物合成”（1,396）、“碳代谢”（1,389）、“内质网中的蛋白质加工”（1,232）、“淀粉和蔗糖代谢”（1,189）和“剪接体”（1,170）是注释到基因较多的途径。和其他组织相比，根蘖芽尖（T5）表现出更多的差异基因（DEG），并且 T5 中的共上调基因主要被注释为参与苯丙烷生物合成。发现甜菜碱醛脱氢酶 (BADH) 是一种高度表达的基因特异于根蘖芽尖（T5）。转录因子的加权基因共表达网络分析 (WGCNA) 和结合生理指标揭示了11个枢纽基因（MEgreen-GA3），其中三个属于HB-KNOX 家族，在根部膨大（T3） 中上调，是调控根蘖性状形成的关键基因。分析了 276 个参与激素信号传导和转导的 DEG，与生长素 (IAA) 信号通路相关的基因数量最多，显着增加水平根（T2）和根蘖芽尖（T5）中的调节。苯丙烷对根蘖发育的整个过程非常重要，苯丙烷类生物合成途径相关的基因数量最多的基因属于 COMT，并且大多数在 R4 中上调。