臭椿有效成分臭椿酮通过靶向LincRNA-ROR/miR-145抑制非小细胞肺癌转移的分子机制

Controlling effectively recurrence and metastasis of lung cancer is the effective methods to treat lung cancer. Long non-coding RNA plays an important role in inhibiting tumor metastasis. LincRNA-ROR is increased in a wide variety of tumor tissues compared with normal tissues, especially in cancer stem cells. LincRNA-ROR can promote the process of tumor cells epithelial-mesenchymal transition (EMT) and maintain the cancer stem cell phenotype by inhibiting miR-145, and then promoting tumor metastasis. In the preliminary study, we found that Ailanthone, which is the effective components of ailanthus, can inhibit the invasion and metastasis of non-small cell lung cancer, and down-regulate obviously the expression of LincRNA-ROR in non-small cell lung cancer cells. But the mechanism of these phenomenons is not clear. So we propose the scientific hypothesis: Ailanthone could inhibit lung cancer cells EMT and cancer stem cell self-renewal, and then suppress the metastasis of non-small cell lung cancer through targeting LincRNA-ROR/miR-145. For this purpose, we will first clarify that LincRNA-ROR/miR-145 is the target of Ailanthone, and then clarify the regulation of the target in non-small cell lung cancer cells invasion and metastasis, EMT and cancer stem cells self-renewal. This work will provide theoretical basis and experimental support for the further antitumor application of Ailanthus.

有效控制肺癌复发和转移是治疗肺癌的有效途径；长链非编码RNA在肿瘤转移中发挥重要作用。长链非编码LincRNA-ROR在肿瘤组织中，尤其是肿瘤干细胞中表达明显增高，可通过抑制miR-145促进肿瘤细胞上皮间质转化及其干性特征的维持，从而促进肿瘤转移。在前期研究中我们发现，中药臭椿有效成分臭椿酮能够抑制非小细胞肺癌细胞侵袭与转移，且能够显著下调非小细胞肺癌细胞中LincRNA-ROR的表达，但具体机制不明。故此我们假设：臭椿酮可通过靶向LincRNA-ROR/miR-145抑制肺癌细胞上皮间质转化及干细胞的自我更新，进而抑制非小细胞肺癌发生转移。为验证这一科学假说，本项目中，我们将首先阐明臭椿酮对LincRNA-ROR/miR-145的靶向作用，之后阐明这种靶向对非小细胞肺癌细胞侵袭转移、上皮间质转化及肿瘤干细胞自我更新的调节，以期为临床上臭椿的抗肿瘤应用提供理论依据与实验支持。

肺癌是发病率及死亡率最高的肿瘤，研究发现LncRNA在肿瘤发生发展及转移过程中发挥重要作用。本项目研究发现臭椿酮可以有效抑制非小细胞肺癌发生发展及转移。通过分析LncRNA芯片结果，并结合TCGA数据库生存期分析，共找到9个可被臭椿酮调节的差异LncRNA：LncRNA-ROR、GAS5、LncPTPN2、LncFRK、IL10RB-AS1、Linc00886、Linc01252、Linc00690、Linc00704。接着对上述LncRNA进行了验证，并以LncRNA-ROR、GAS5、LncPTPN2、LncFRK作为重点研究对象。由于非小细胞肺癌细胞中干细胞表达比例极低，造成LncRNA-ROR很难被检测到，故舍去。细胞克隆及Transwell实验结果提示，臭椿酮可以通过上调LncPTPN2、LncFRK抑制肿瘤发生发展。GAS5属于肿瘤抑制基因，但对肺癌增殖、转移的抑制作用报道较少，因此本项目以GAS5为靶点研究臭椿酮对肿瘤的抑制作用具有重要意义。TCGA数据库显示，GAS5高表达肺癌患者预后良好，说明GAS5可以作为预测肺癌患者预后的生物学标志。进一步研究发现，臭椿酮可通过剂量依赖方式显著上调肺癌细胞系GAS5表达，且证实肿瘤细胞中GAS5表达降低是引起肿瘤耐药发生的原因之一。我们使用慢病毒载体构建了sh-GAS5稳转细胞系，RT-QPCR及原位杂交实验均证实，臭椿酮可以上调GAS5表达。动态细胞增殖实验、实时动态细胞转移实验、克隆形成实验及Transwell实验均提示，臭椿酮对非小细胞肺癌转移的抑制作用部分依赖GAS5。Western Blot实验结果显示，臭椿酮对非小细胞肺癌上皮间质转化的抑制作用也部分依赖GAS5。为了确定GAS5的下游靶标，我们进行了miRNA测序，发现臭椿酮可以显著抑制非小细胞肺癌中miR-205-5p表达。且双荧光素酶报告基因实验也证实，GAS5可以与miR-205-5p发生结合，说明miR-205-5p是臭椿酮调控GAS5表达的下游靶点。接着通过基因芯片检测分析及相关验证实验，发现INTS6、PTEN可能是GAS5/miR-205-5p作用的下游靶点。体内实验也证实，GAS5敲除后可以逆转臭椿酮对肿瘤的抑制作用。本项目研究证实，GAS5/miR-205-5p可作为臭椿酮治疗肿瘤的靶点，及患者预后生物学标志。