Exosome介导let-7靶向治疗乳腺癌的实验研究

James E. Rothman and his partners were awarded the 2013 Nobel Prize in physiology or medicine by founding the transport mechanism of exosome. The exosome is a membranous vesicles nanostructure of cell secretion, as a natural transportation system, specific biomacromolecule can be efficiently transported to the target cells.Let-7 is identified with broad-spectrum anti-tumor effects of microRNA molecules.How to deliver let-7 to the tumor cells specifically and efficiently and thereby realizing targeted therapeutic effects is currently existing problem to be solved.The research group have prepared tumor-specific nucleic acid aptamers targeting modification of exosome on the basis of already mastering exosome large extraction and purification technology, and initially confirmed that the system can efficiently deliver let-7 to external cultured breast cancer cells.This project aims to study the efficiency and specificity of target modified exosome delivery of let-7 and the inhibition effect on breast cancer cell in vitro.Then focus on the analysis of the system's stability, toxicity and immunogenicity, thus the treatment and evaluation could be done upon murine model of breast cancer, in order to provide targeted therapy of breast cancer with new ideas and approaches.

詹姆斯o罗思曼等人因发现了exosome的运输机制而荣获2013年诺贝尔生理医学奖。exosome是细胞分泌的一种膜性囊泡纳米结构，作为天然的货物运输系统，它可将生物大分子特异高效地运输到靶细胞。let-7是已发现具有广谱抗肿瘤作用的microRNA分子。如何将let-7特异高效的递送到肿瘤细胞，从而实现靶向治疗作用，是目前亟待解决的问题。课题组在已掌握exosome大量提取与纯化技术的基础上，制备了肿瘤特异性核酸适配子靶头修饰的exosome，并初步证实该系统可以高效地将let-7递送至体外培养的乳腺癌细胞。本项目拟重点研究靶头修饰后的exosome递送let-7的效率及特异性，及其对体外乳腺癌细胞的抑制效果；然后重点分析该系统在小鼠体内的稳定性、毒性和免疫原性，从而对小鼠乳腺癌模型进行治疗与评价，以期为乳腺癌的靶向治疗提供一种新的思路和途径。

小核苷酸如 microRNA、siRNA 等作为药物应用于多种疾病的临床治疗潜力巨大，但将核酸药物高效靶向性地递送到目标器官或目标细胞是十分困难的。因此设计和选择适宜的递送载体是目前核酸药物临床应用亟待解决的问题。exosome是由细胞分泌的囊泡，内部包含多种蛋白质、核酸、脂质等生物大分子。exosome 可将供体细胞来源的蛋白或核酸传递到受体细胞中，起到信号传递、物质运输等功能。基于核仁素在多种癌细胞（如乳腺癌细胞）膜表面高水平表达，且核酸适配体 AS1411 可以特异性识别并特异性结合膜表面核仁素蛋白，故本研究采用核酸适配体 AS1411 修饰 exosome 来构建一个可以靶向递送 microRNA 或 siRNA 到乳腺癌细胞的核酸药物递送系统，并研究其抗肿瘤的作用。本研究通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析技术，首先在体外细胞水平验证了 AS1411-exosome 靶向递送 microRNA 到三阴乳腺癌细胞 MDA-MB-231 中的效率和特异性；接着采用小动物活体成像技术验证 AS1411-exosome 递送荧光素标记的 microRNA至荷瘤裸鼠体内乳腺癌的效率和靶向特异性；同时在体实验研究未发现 AS1411-exosome 有明显的毒性和免疫原性。之后，我们选择具有抑癌功能的 microRNA let-7 和 siRNA-VEGF 作为核酸药物的代表，通过 AS1411-exosome 分别将其特异性的递送到乳腺癌细胞中，Realtime PCR 和 Western Blot 方法检测核酸药物的靶基因表达情况。结果表明，microRNA let-7 的靶基因 K-RAS和cMyc 以及 siRNA-VEGF 的靶基因 VEGF的表达均下调。更为重要的是，在荷瘤小鼠体内，通过 AS1411-exosome 靶向递送 let-7后，小鼠的肿瘤生长明显被抑制（抑制率达57%）。本研究设计并构建的这种新型的靶向乳腺癌的小核酸递送系统，为核酸药物肿瘤治疗提供了新思路及实验支持和理论参考。