VSTM1调控单核/巨噬细胞功能及动脉粥样硬化发生发展的体内外研究

Atherosclerosis is detrimental to human health. Monocyte/macrophage function stimulated by oxLDL is essential for the origin and development of atherosclerosis. We have found that VSTM1 level is lower in acute coronary syndrome patients than stable patients. Our further experiments demonstrate that VSTM1 plays a vital role in regulating THP-1 monocyte/macrophage function via VSTM1-SHP-1-CREB pathway. Thus, by using pLenti-VSTM1 and pLenti-VSTM1 shRNA interference, we aim to find the effect of VSTM1 on human peripheral monocyte/macrophage cell migration， apoptosis， inflammation， and oxLDL uptake in this study. Point mutation，Co-IP and Rescue study will be applied to verify downstream genes of VSTM1. Furthermore，we will establish monocyte/macrophage specific VSTM1 over-expression/knockout transgenic mouse model in attempt to carry on a further vivo study. This vivo study is on purpose of verifying the role and mechanism of VSTM1 in monocyte/macrophage function and atherosclerosis formation.

动脉粥样硬化（AS）严重危害人类健康，oxLDL激活单核/巨噬细胞生物学功能对AS发生发展具有关键意义。项目组初步研究已发现，急性心血管事件患者单核细胞VSTM1表达明显下调；进一步的研究发现VSTM1对THP-1单核/巨噬细胞系功能具有重要调控作用,该作用可能同激活SHP-1/CREB信号通路有关。本项目拟在此基础上，针对人外周血单核细胞，分别体外转染VSTM1 过表达载体及shRNA慢病毒载体，从正负两个方面的效应研究VSTM1调控人外周血单核/巨噬细胞趋化侵袭、凋亡功能、炎症释放、脂质吞噬的作用；通过点突变技术、免疫共沉淀技术及Rescue study，进一步证实VSTM1的作用机理；最后通过构建单核/巨噬细胞特异性过表达/敲除VSTM1的AS小鼠模型，体内验证VSTM1对单核/巨噬细胞功能及AS发生发展的调控作用，以期为AS的防治提供新的研究靶点和思路。

目的：研究VSTM1 对单核/巨噬细胞功能的影响，以及探讨单核细胞表面VSTM1的表达水平与冠状动脉病变的相关性及临床意义。方法：分离人外周血单核/巨噬细胞，分别采用体外转染p-Lenti-VSTM1 shRNA和p-Lenti-VSTM1，从正负两个效应方面研究oxLDL 刺激下单核/巨噬细胞迁移趋化、凋亡、分泌炎症因子、脂质吞噬等一系列生物学功能改变。并连续入选2017年11月至2018年8月我院收治的确诊或疑诊冠心病而行冠状动脉造影检查的患者210例，依据患者冠状动脉造影检查结果，分为对照组和实验组，比较各组VSTM1水平， 并计算SYNTAX 积分，探讨各组患者VSTM1水平以及与 SYNTAX 积分和病变支数的关系。结果：1）干扰组VSTM1的表达水平显著下降，表明干扰组的转染效率高；过表达VSTM1的U937细胞VSTM1蛋白表达量明显增加；2）添加ox-LDL后干扰VSTM1组U937侵袭性明显降低。加入ox-LDL后，各组细胞上清中HMGB1的含量都会略有上升，而在SHP1干扰组中，加入100ug/ml ox-LDL后HMGB1的分泌量显著上升；3）加入ox-LDL后，各组细胞上清中HMGB1、MMP9的含量都会略有上升，而在SHP1干扰组中，加入100ug/ml ox-LDL后HMGB1、MMP9的分泌量显著上升；在U937和U937 NC细胞上清中，IFNa、TNFa、IL-8含量较低，在加入ox-LDL后，IFNa、TNFa 和IL-8的分泌量随着ox-LDL剂量的增加显著上升。4）control组与NC组的红色荧光强度接近，均略高于未添加Dil-ldl的细胞，而干扰VSTM1组的细胞红色荧光强度明显高于control组和NC组。5）在干扰了VSTM1、SHP1的细胞中添加oxLDL（200 μg/ml）后，检测细胞ROS的释放情况， shVTSM1与shSHP1组的细胞ROS的释放量明显高于control和NC组。6）不稳定性冠心病组的VSTM1水平显著低于稳定性心绞痛组和对照组(P<0.05)。7）SYNTAX 积分的高分组和中分组VSTM1表达浓度低于低分组和对照组（P<0.05）。科学意义: 单核细胞表面VSTM1的表达水平与动脉粥样硬化斑块的稳定性具有一定的相关性，检测单核细胞表面VSTM1表达水平可用于评估冠状动脉病变的进展。