S. maltophilia DHHJ胞外胞内酶降解羽毛角蛋白协同增效作用机制解析

禽类羽毛主要成份为角蛋白，是地球上最大的氮源废弃物之一，炼制产物用途广泛，生物炼制由于多种优点而成为目前潮流。酶是大分子物质生物炼制的关键因素，但当前角蛋白酶种类及作用方式不明，成为该方法产业化应用的瓶颈。申请者分离鉴定了一羽毛高效降解菌株（S. maltophilia DHHJ），并发现该菌株降解羽毛的活性依赖于胞内胞外酶协同作用。本项目在此基础上拟将纯化的胞内胞外酶独立及组合作用于羽毛，并且利用包括扫描电镜（SEM）、傅立叶红外光谱、拉曼光谱、能谱分析（EDS）在内的技术分析角蛋白酶降解过程及表面及截面动态变化情况；另一方面克隆胞内和胞外酶基因，推测酶蛋白结构及功能。综合以上实验及理论两方面深入解析DHHJ菌株角蛋白酶两种酶的协同增效作用机制。本项目的完成，将为角蛋白酶的应用提供理论支持，同时为酶分子改造及构建杂合酶奠定基础，具有重要的理论意义和应用价值。

羽毛作为畜牧业副产物及自然界最大的氮源生物废弃物，其资源化利用对环境保护及可持续发展具积极意义。我们分离鉴定出一高效降解羽毛细菌（S.maltophilia DHHJ），在前期工作基础上及自然基金资助下完成以下工作：. 优化了S. maltophilia DHHJ 5 L发酵罐工业化降解羽毛工艺，明确了发酵产物主要成分（可溶蛋白大小为10-160kD），并研究了其作为叶面肥，护发素主要成分的应用。. 通过提取胞外胞内酶处理羽毛，发现其共同降解羽毛效果高于单独作用。FTIR分析显示，胞外胞内酶协同处理后在1025 cm-1 (S-O)，1540cm-1 (C-N、N-H)，1640-1 (C=O)，2920-1 (O-H)处出现差异，这与硫键及肽键打开相关。X射线结果通过Scherer公式计算，羽毛结晶度为 28.23%，其经胞外胞内酶协同处理后结晶度提高到34.46%，材料内部结构变得更为规则，酶及其它因子的触及性下降，更加难以作用。利用扫描电镜（SEM）及透射电镜（TEM）观察该菌在牛肉膏蛋白胨及羽毛两种培养基中细胞形态，发现羽毛培养基上细胞表面产生大量凹陷，细胞膜发生内褶。表明羽毛片段需进入细胞，在膜或膜内因子作用下进一步降解，作为营养成份供细菌代谢生长。. NanoLC-MS/MS结合PCR获得胞外酶（α/β水解酶）及胞内酶（aldo/keto 氧化还原酶）全基因序列，胞外酶蛋白中含有大量螺旋状结构，其与角蛋白中的α-螺旋结构互补结合，有利于酶底物的结合及羽毛降解。利用TMpred分析了aldo/keto氧化还原酶跨膜结构域，其有一个跨膜区，表明为膜蛋白，在膜上将胞外酶水解的角蛋白片段进一步氧化处理利用。同时，细菌降解羽毛过程中有磷酸盐结合蛋白、外膜孔蛋白、肽结合蛋白、周质氨基酸转运蛋白、ompF蛋白家族等参与。这说明酶虽然是微生物降解角蛋白的必要条件，但不是充分条件，除此外，还需要其它分子参与。而解析这些分子功能对于彻底了解羽毛生物炼制，提高降解效率至为关键。. 本项目执行过程中发现细菌代谢产生H2O2可提高羽毛降解效率，研究了其代谢规律及体内外对酶降解羽毛的促进作用，该结果为微生物降解羽毛机理研究提供一条新的线索，同时也可为产业化应用提供新思路。