M-CSF、RANKL基因联合沉默抑制磨损颗粒诱导假体周围骨溶解的研究

Wear particle play an important role in periprosthetic osteolysis which leading to the loosening of the prosthesis , while osteoclasts are very important to the biological processes.Recent studies showed that M-CSF and RANKL are two most crucial factors in osteoclasts generation and differentiation.But mutual relations and their mechanism of action between the two genes have not been reported. This project mainly studies the target spot take M-CSF and RANKL, constructing the wear particles induced periprosthetic osteolysis in animal models and jointly silencing their M-CSF and RANKL gene,which synergisticly inhibit osteoclast from generating and differentiating. so as to prevent the biological process of wear particle-induced periprosthetic osteolysis.Besides，we can also confirm the reciprocity and the function mechanism of the two genes in vitro experiment. This idea has not been elaborated at home and abroad, to prove the rationality and effectiveness of the theory we can found a new solution to inhibit periprosthetic osteolysis induced by wear particles and could also broaden the application of RNAi.

磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解是导致假体松动的一个重要原因，而破骨细胞在该生物学过程的发生过程中起了重要的作用，目前研究发现M-CSF与RANKL是破骨细胞生成与分化过程中最关键两种因子，但二者之间的相互关系及其作用机制尚未见报道。本项目主要以M-CSF和RANKL为研究靶点，首先通过构建磨损颗粒诱导假体周围骨溶解的动物模型并对其进行M-CSF与RANKL基因联合沉默，以实现协同抑制破骨细胞的生成及分化，从而有效地预防磨损颗粒诱导假体周围骨溶解的发生，同时通过体外实验证实这两种因子之间的相互关系及其作用机制。上述研究方法及理论在国内外尚未见文献报道，如能证明其合理有效，既为预防假体周围骨溶解的发生提供了新的解决方案，亦为基因沉默技术的应用研究拓宽新的思路。

人工关节置换术是治疗严重关节疾患、重建关节功能的重要手段。随着关节置换病例数目的增加和术后患者使用时间的延长，假体松动成为日益突出的术后并发症。磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解是导致假体松动的一个重要原因，巨噬细胞和破骨细胞吞噬磨损颗粒后释放炎症因子并促进破骨细胞形成。在此病理过程中，核因子KB受体激活子（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage -colony stimulating factor，M-CSF）是造成骨吸收和炎症反应的关键因素。本课题旨在构建携带M-CSF的siRNA和核因子KB受体激活子（RANKL）siRNA的重组慢病毒载体，并且在钛颗粒诱导的炎症反应细胞模型中检验该慢病毒对钛颗粒所引起的炎症反应和破骨细胞形成的作用。在用钛颗粒分别对RAW264.7和MC3T3-E1细胞进行刺激后将构建好的空慢病毒载体、lenti- siM-CSF、lenti-RANKL、以及Lenti-siM-CSF-RANKL慢病毒载体分别转染RAW264.7和MC3T3-E1细胞。将RAW264.7和MC3T3-E1细胞在transwell小室中以0.1mg/ml的Ti颗粒浓度进行共培养，并检测对炎症反应的抑制情况。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色对活化破骨细胞进行计数。通过酶联免疫测定法，检测细胞中OPG的蛋白表达水平。用反转录定量聚合酶链式反应分析来测量M-CSF以及RANKL的mRNA及蛋白表达水平。并且使用碱性磷酸酶试剂盒来检测碱性磷酸酶（ALP）的活性。由于Lenti-siM-CSF-RANKL慢病毒载体的影响下，M-CSF和RANKL的mRNA表达水平下调， OPG mRNA的表达和蛋白水平均上调，ALP活性增加。TRAP染色阳性细胞数量减少。体外实验结果表明Lenti –siM-CSF-RANKL能抑制磨损颗粒诱导的炎症反应和破骨细胞的形成，为磨损颗粒引起的骨溶解的治疗和预防新的解决方案，亦为基因沉默技术的应用研究拓宽新的思路。本项目已顺利完成，截止目前发表SCI收录论文1篇，中文核心期刊论文1篇。