猪链球菌2型的脑微血管内皮细胞黏附素筛选及各黏附素的细胞致病作用研究

用pH连续梯度电泳仪和液相制备色谱仪制备猪链球菌2型（SS2）的胞壁蛋白，点样制备低密度芯片；原代培养仔猪脑微血管内皮细胞（BMEC）；BMEC和芯片共孵育使其黏附在黏附素位点；经胞壁蛋白介导、荧光抗体差异显示，筛出SS2全部的BMEC黏附素。并研究各黏附素对BMEC的黏附、诱导凋亡、细胞间隙调节和细胞毒性作用。其意义：1澄清SS2对BMEC的完整黏附素阵容及各黏附素对BMEC的作用，是SS2致病机理研究的突破性进展；是全面研究致脑膜炎分子机理的新起点；2为研制黏附素亚单位疫苗奠定基础，后者在理论上可完全阻断SS2感染和脑膜炎发生，有巨大应用价值，对养猪业、尤其是公共卫生意义重大；3用高通量高效率高灵敏的蛋白质-细胞芯片黏附试验替代传统的黏附素单钓策略，特异准确且高效经济；4验证独创的蛋白质-细胞芯片黏附试验作为新方法，其应用可靠性和准确性，为其它病原微生物筛选黏附素提供新的技术平台。

1）pH连续梯度电泳分离纯化猪链球菌2型（SS2）的胞壁蛋白，SDS-PAGE鉴定达到电泳纯。2） 原代培养SPF新生仔猪血管内皮细胞（BMEC），并经SPF-SV40-T-pCR3.1转化。3）用蛋白质-细胞芯片黏附技术筛选出SS2的4种BMEC黏附素。分子量分别为39KD、44KD、88KD和136KD。4） 39KD黏附素可诱导猪肺泡巨噬细胞和BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞27%高水平凋亡。5）39KD黏附素可诱导猪肺泡巨噬细胞炎性因子 TNF-α、IL-1、IL-6的表达量显著上调（P<0.01）。6）SS2感染Balb/c小鼠，大脑组织切片H.E.染色镜检发现脑膜下广泛出血，透射电镜观察脑细胞水肿和凋亡。7）SS2 感染Balb/c小鼠巨噬细胞，先黏附、再诱导凋亡。8）SS2可黏附红细胞,并能引起红细胞的皱缩，胞膜吐泡。9）链球菌多重PCR诊断方法的建立。据GenBank 已登录基因序列，针对链球菌属特异性链球菌延伸因子EF-TU基因、SS种特异性谷氨酸脱氢酶基因GDH和马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因M-like、SS型特异性荚膜多糖基因（SS1型CPS1I 、SS2型CPS2J、SS7 型CPS7H 和SS9 型CPS9H）设计合成7对引物，建立多重PCR方法，能够一次性诊断链球菌属、猪链球菌和C群马链球菌兽疫亚种，并同时对猪链球菌主要致病型1 、2 、7 、9 型直接定型。10）在进行本研究过程中，在猪组织检样中检出了2种病毒，在我国首次检出。