tk基因/GCV对瘢痕组织中成纤维细胞增生的抑制研究

从tgCMV/HyTK质粒中切取HyTK基因片段（其中含HSV1-TK基因），将HyTK基因替换病毒载体G1Na中的neo基因，构建成重组逆转录病毒载体GTK。用脂质体Lipofectin将GTK导入混合包装细胞双噬性PA317GP+E-86细胞中，培养并筛选高滴度阳性克隆，获得的重组病毒滴度达10（6）CFU/ml。从增生性疤痕和疤痕疙瘩的患者的患处取材，采用组织块帖壁法进行培养，采用S-P染色及真空负压法对培养的FB进行鉴定，证明其为能够产生Ⅲ型原胶原蛋白的成纤维细胞（FB），该细胞用作基因治疗的靶细胞。重组逆转录病毒GTK转染瘢痕病人的FB后，用hygromycin B筛选出阳性细胞克隆（FB/GTK），经PCR方法检测证明HyTK基因已成功地导入FB中，但不含可复制的辅助病毒。分别用不同浓度的GCV作用于FB/GTK及FB，光镜下观察不同时间后细胞形态变化及MTT法检测细胞活性。结果表明，GCV浓度大于0.1μmol/L时即对FB/GTK有显著的杀伤作用，且具有强有力的“旁观者效应”。通过电镜及琼脂糖凝胶电泳分析表明结果TK/GTK系统介导的成纤维细胞死亡部分是由于通过细胞凋亡途径实现的。