UBE2s在DNA损伤修复中的功能及作为恶性胶质瘤放化疗靶标的研究

Glioblastoma multiforme (GBM) presents one of the greatest challenges in the management of cancer patients worldwide. It is basic and clinic research frontiers to find biological markers of GBM and to develop a serial of therapy stratries. We have found that UBE2s was highly expressed in glioblastoma cell lines and in the clinical samples from GMB patients. UBE2s phosphorylation and its stability was regulated by PTEN-AKT pathways.The UBE2s was also found as the new component of nonhomologous end joining (NHEJ) complex (Ku70-Ku80-DNA-PKCs）in our previous studies. Based on the anti-UBE2s monolconal antibody developmented in our lab,a novel immunohistochemistry kit will be established and will be benefit for the clinic application. The correlation of clinical outcome of GBM with UBE2s highly expression and tolerance to the radation or/and chemotherapy will be tested with clinical followup program. The function of UBE2s involved in damaged-DNA repair throuh NHEJ complex and its roles in tumor development process will be investigated. The molecular mechanism of UBE2s localization and degradation will be investigated. A serial of novel combination assays of radiation and chemotherapy for gliomablastoma cells and tumor-burdened model with UBE2s high expression will be exerted.

恶性胶质瘤的治疗一直是癌症领域最具挑战性的难题之一，发现恶性脑胶质瘤新的标志物并利用其作为放化疗新药物靶点是该领域基础研究和临床应用的前沿。我们前期的实验结果表明：UBE2s在恶性胶质瘤细胞系和病人组织中高水平表达；PTEN-AKT信号通路能调节UBE2s磷酸化及其稳定性； UBE2s是非同源末端连接复合物的一个新组分，可能参与损伤DNA的修复并与肿瘤的耐受放化疗有关。本研究拟采用抗UBE2s单克隆抗体对临床样品筛查、并通过分子生物学方法和建立荷瘤裸鼠放化疗模型，研究UBE2s高水平表达与恶性胶质瘤细胞耐药性及病人不良预后之间的关系；探讨UBE2s在DNA损伤修复及其在癌症发生发展中的作用；开展UBE2s作为新放化疗靶点的研究。以UBE2s抗体为基础，开发免疫组化检测试剂盒，针对PTEN-AKT-UBE2s通路设计新的放化疗方案。

背景及目的: . 胶质瘤是神经系统常见的恶性肿瘤，其固有的放化疗抵抗是目前难以治愈的主要原因之一。发现放化疗耐受的分子标志物对指导胶质瘤患者的治疗，优化放化疗方案具有重要意义。.方法:. 通过分析基因芯片数据发现UBE2S在恶性胶质瘤中显著差异表达，通过免疫组化验证这一结论。利用放线菌酮（Cycloheximide, CHX）处理发现UBE2S是一个不稳定蛋白，其稳定性受PTEN/Akt信号通路调控。进一步用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）实验发现UBE2S与Akt1存在直接的相互作用，并且UBE2S是Akt1的磷酸化底物，其磷酸化位点是Thr152。为了研究UBE2S的新功能，我们用GST-Pulldown和蛋白质谱（LC-MS/MS）发现UBE2S与Ku70、Ku80和DNA-PKcs形成复合物。为了验证UBE2S是否参与DNA损伤非同源末端链接（NHEJ）修复，我们利用共聚焦、in vitro NHEJ end joining、彗星实验等证实了这一结论，并且通过细胞凋亡和动物实验证实UBE2S确实与放化疗耐受有关。.结果: . UBE2S在低级别胶质瘤和正常脑组织中低表达，在高级别胶质瘤中高表达。在恶性胶质瘤中UBE2S与Akt共表达。UBE2S在PTEN野生型细胞中降解较快，其降解能被蛋白酶体抑制剂阻断。UBE2S与Akt1相互作用，Akt1磷酸化UBE2S，磷酸化位点为Thr152。UBE2S与Ku70、Ku80存在直接相互作用，UBE2S能促进Ku70的蛋白表达上调。DNA损伤药物处理后，与UBE2S结合的Ku70蛋白水平增加。利用shRNA敲低UBE2S的表达以后，NHEJ修复效率下降，DNA损伤增加，细胞凋亡增加。.结论:. UBE2S在恶性胶质瘤中高表达，其稳定性受Akt1调节。UBE2S与Ku70存在直接的相互作用，参与NHEJ修复。敲低UBE2S能增强胶质瘤的放化疗敏感性，UBE2S有望成为新的胶质瘤治疗靶点。