Canp4调节DNA损伤修复影响鼻咽癌放化疗敏感性

Radiotherapy is the major method for Nasopharyngeal carcinoma (NPC) treatment, which generally leads to good effect. However, resistance and recurrence eventually emerge. Chemotherapy is applied for terminal stage of NPC or patients with metastasis NPC. Similarly, resistance occur. Our previous study demonstrated that Capn4 was an important malignant index of biological behavior in nasopharyngeal carcinoma, which was closely related to resistance of radiotherapy and chemotherapy in NPC cells. Additionally, there are some reports that Capn4 is related to DNA damage repair. Based on these findings, this project try to investigate whether Capn4 will regulate DNA damage repair and which DNA repair pathway will be involved in; how dose Capn4 interfer with DNA damage response signaling; explore the molecular mechanism that Capn4 regulates DNA damage repair through looking for "docking protein X", then validate the interaction between Capn4 and "docking protein X". Finally, if suppression of Capn4 will sensitize NPC cells to DNA damaged agents and radiotherapy iv vitro and in vivo. In conclusion, this project will clarify the mechanism of DNA damage repair and provied new clue for reverse resistance of radiotherapy and chemotherapy in NPC cells.

鼻咽癌的主要治疗手段是放疗，总体疗效较好，但仍有较多患者出现放疗抵抗和复发。对晚期或已发生转移的鼻咽癌患者还需联合化疗，在治疗过程中也出现了对化疗药物耐药的现象。我们前期工作表明Capn4是一个重要的鼻咽癌恶性生物学行为指标，与放化疗抵抗密切相关。由于DNA损伤是放化疗杀伤鼻咽癌细胞的主要机制，DNA损伤修复的激活可以导致放化疗抵抗。此外，有文献报导Capn4与DNA损伤修复有关。基于这些发现，本课题拟研究Capn4是否直接影响鼻咽癌细胞DNA损伤修复及其修复途径；探讨Capn4抑制对鼻咽癌细胞DNA损伤应答信号的影响；探讨Capn4调控DNA损伤修复的分子机制，寻找“对接蛋白X”， 验证Capn4与“对接蛋白X”的相互作用；检测Capn4抑制能否在体外和体内增敏DNA损伤药物及放疗杀伤鼻咽癌细胞的作用。总之，本课题希望能阐明Capn4调控DNA损伤修复的机制，为鼻咽癌放化疗增敏提供新思路

【目的】1、用 Capn4 表达构建 CNE2 细胞系，探讨放射性分解酶和 DNA 损伤对依托泊苷 (Vp16)诱导的鼻咽癌 CNE2 修复的影响。2、调查 Capn4 对鼻咽癌放疗和化疗敏感性的作用及潜在的分子机制。 【方法】 1、Western-blot 方法检测 Capn4 在鼻咽癌细胞系中 CNE2 及人肾细胞 293T 中 的蛋白表达水平；2、用shRNA构建 Capn4下调细胞；3、高内 涵分析仪分析 VP-16 及放射诱导的 CNE2 γ-H2AX 的焦点荧光情况；检测非同源末端连接(NHEJ)通路的特异性的质粒 EJ5-GFP 用 Fugen6 HD 转入空载的 CNE2 细胞及下调 Capn4 的 CNE2 细胞中 GFP 的阳性率；检测 VP-16 及放射诱导空载的 CNE2细胞及下调 Capn4 表达的 CNE2 细胞 DNA 损伤修复中 Ku80 的表达；5、应用实时荧光定量 PCR 检测空载的 CNE2 细胞 及下调 Capn4 表达的 CNE2 细胞的 Ku80 转录水平的变化；6、采用四甲基偶氮唑 蓝(MTT)法和集落形成法体外检测 VP-16 诱导的空载的CNE2 细胞及下调 Capn4 的 CNE2 DNA 损伤后对细胞增殖抑制的影响；7、免疫共沉淀法分析 Capns1 与 NHEJ 修复通路相关蛋白的关系；9、体内异种移植瘤模型检测 VP-16 对下调 Capn4 表达鼻咽癌肿瘤的抑瘤率。【结果】 1、 Capn4 在鼻咽癌细胞CNE2 中的表达显著高于正常人肾细胞，shRNA 确实下调 Capn4 在 CNE2 细胞中的表达；2、高内涵分析显示下调 Capn4 表达对放射诱导的 CNE2 细胞 DNA 损伤 γ-H2AX 的荧光焦点比例增高； 3、高内涵分析显示下调 Capn4 的表达能够抑制 CNE2 细胞 DNA 损伤后 NHEJ 修复通路；4、下调 Capn4 表达能够抑制 VP16 及放射诱导的 CNE2 细胞 NHEJ 通路相关蛋 白 Ku80 的表达；5、免疫共沉淀法分析显示 Capn4 与多种 NHEJ 修复通路蛋白相结合；6、下调 Capn4 表达能够抑制 CNE2 细胞体外和异种移植瘤增殖。【结论】Capn4 在鼻咽癌细胞中高表达，其通过KU80调控NHEJ修复途径，下调Capn4能增敏鼻咽癌放化疗。