藏药—唐古特红景天活性成分干预低氧性肺动脉高压的离子通道机制研究

Hypoxic pulmonary hypertension is pathological basis of plateau pulmonary edema and high altitude heart disease. Ion channels participated in hypoxic pulmonary hypertension of occurrence and development process. Our previous study found Tibetan Medicine，Rhodiola algida var. tangutica, especially its active parts intervene hypoxic pulmonary hypertension by expanding lung small artery. However, the mechanism is not yet clear, we deduce that this drug play a role of intervention of hypoxic pulmonary hypertension by potassium and calcium ion channels in pulmonary vasoconstriction and cell proliferation levels. Therefore, we proposed to do the following work: 1. Use patch clamp and molecular biology technology, observe channel current and channel protein expression changes of voltage dependent potassium channel(Kv), large conductance Ca2+-activated potassium channel(BKca) and Voltage dependent L-Ca2+ channel, Store-operated Ca2+ channel(SOC). 2. By immunofluorescence and confocal laser scanning microscopy, observe intracellular calcium ion concentration [Ca2+]i change and Store-operated Ca2+ entry(SOCE) in the pulmonary artery smooth muscle cells. 3. Adopt MTT, FCM, and molecular biology techniques to investigate pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and the expression of CaN, NFAT, Bcl - 2, CDK2 and RhoA on the Ca2+-CaN-NFAT signal pathway.

低氧性肺动脉高压是罹患高原肺水肿、高原心脏病等高原性疾病的初始病理环节。离子通道参与了低氧性肺动脉高压的发生和发展过程。本课题组前期研究发现藏药唐古特红景天，尤其是活性组分通过扩张肺细小动脉干预低氧性肺动脉高压的发生。然而，机制尚不清楚，我们推断该药是通过钾离子和钙离子通道在肺血管收缩和细胞增殖层面对低氧性肺动脉高压发挥干预作用。为此，我们拟做以下工作：1. 采用膜片钳和分子生物学技术，考察该药对钾通道（Kv、BKca）和钙通道（L型Ca2+通道、钙库操纵的钙通道SOC）通道电流和通道蛋白表达的影响。2. 采用免疫荧光和激光共聚焦扫描显微镜技术，考察该药对肺动脉平滑肌细胞 [Ca2+]i水平及对SOC的钙内流的影响。3. 采用MTT、流式细胞仪、分子生物学技术等考察该药对肺动脉平滑肌细胞增殖和Ca2+-CaN-NFAT信号通路上的CaN，NFAT，Bcl-2，CDK2和RhoA表达的影响。

本项目首先分离了大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC），进行培养和鉴定。然后利用酶标仪通过CCD8检测细胞活力，最终成功建立了大鼠肺动脉平滑肌低氧模型（3%O2，24h）和藏药唐古特红景天活性组分（ACRT）药物浓度（50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL）。. 通过膜片钳检测ACRT（200ug/mL）对低氧条件下PASMC上的电压依赖性钾离子通道瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流的影响。分别采用细胞旁即时給药和提前孵育给药，发现即时药物干预后钾电流仍呈继续减小趋势，未见明显恢复。而ACRT提前干预对低氧条件下PASMC的电压依赖性钾通道电流具有一定恢复作用，且对低氧灌注再损伤有一定的保护作用。接下来发现ACRT可上调低氧条件下PASMC上K+通道Kv1.5、BKCa亚基蛋白和基因的表达水平，从而提高K+通道活性，提高钾电流，同时膜片钳数据给予了佐证。. 激光共聚焦显微镜检测ACRT浓度梯度处理PASMC后发现ACRT可明显降低低氧造成的PASMC胞内Ca2+浓度的升高。进一步发现ACRT可下调低氧条件下PASMC上不论是电压依赖性钙通道亚基Cav1.2还是电压非依赖性钙通道SOC亚基TRPC1、TRPC6、STIM1、Orai1蛋白和基因的表达，从而降低Ca2+通道活性，最终降低PAMSC胞内Ca2+浓度，从而起到抑制血管收缩、舒张肺血管的作用。. 流式细胞仪检测结果发现，通过ACRT浓度梯度处理PASMC后，增殖期细胞逐渐减少，且有一定浓度依赖性。表明ACRT可抑制PASMC的增殖。进一步发现ACRT浓度梯度处理PASMC后，HIF-1a，NFAT，CDK和RhoA mRNA水平表达有所下降，且呈浓度依赖性，其中Blc-2影响不明显，说明ACRT可通过Ca2+-CaN-NFAT信号通路抑制PAMSC的增殖，从而达到抵抗肺动脉血管中层肥厚，逆转低氧性肺血管重构。. 并通过低压氧舱构建了低氧肺动脉高压大鼠模型。分离肺小血管采用iTRAQ进行了蛋白质组学研究。结果显示共鉴定出3204个蛋白，其中49个蛋白上调，46个蛋白下调。缺氧组在钙稳态、嘌呤代谢、肿瘤、脂肪细胞代谢等方面的KEGG富集通路显著富集。. 阐明藏药唐古特红景天干预治疗低氧性肺动脉高压的作用机理，为高原缺氧性疾病治疗用药和藏药的二次开发提供新思路。