甘蔗SPS D家族基因光暗磷酸化位点的调控机制研究

Sucrose-phosphate Synthase (SPS) is one of the key enzymes in the sucrose metabolism and is therefore critical in plants' biological processes. SPS D2 belongs to the monocot-specific SPS D subfamilies and is abundantly expressed in sugarcane. Prior analysis of SPS D2-deduced amino acid sequence indicated that the gene coded only a main dark-light regulation phosphorylation site, S-153. Indeed, subsequent confirmation via Western blot has revealed that SPS-D2 S-153 is regulated by dark-light in sugarcane. Hence, in theory, site mutation of SPS-D2 S-153 would reduce the phosphorylation levels of dark-light regulation site resulting in an increased SPS enzyme activity. Here we propose a study to investigate the mechanism of phosphorylation of SPS D2 S-153 in sugarcane. In the study, multiple site-directed mutations in SPS D2 S-153 will be transferred to A. thaliana orthologous gene (At5g1110) KO mutant. Recombinant protein from both the site-mutated and wild type SPS D2 S-153 in the transgenic A. thaliana's will then be isolated and purified to identify the potential phosphorylation kinase for SPS D2 S-153. The phenotype, carbohydrate expression and phosphorylation levels of SPS D2 S-153, as well as the SPS activity of the transgenic A. thaliana plants will be surveyed. Specifically, the objectives of the study are: 1) to elucidate the phosphorylation mechanism of dark-light regulation site in the monocot-specific SPS D subfamilies, and 2) provide a framework for genetically modifying the SPS gene.

蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因是植物糖份代谢的关键酶基因。甘蔗中，高丰度表达的SPS D2是单子叶植物特异的D家族基因，主要磷酸化位点仅保留受光调控的S-153，前期的研究确认了该位点明显受光调控，由此推测反义突变该位点将抑制光调控磷酸化，明显降低SPS D2的磷酸化水平，提高该酶活性。本项目拟用免疫杂交方法验证所预测的甘蔗SPS D2 S-153位点的光暗调控磷酸化；进而对该位点进行反义突变，转化到垂直同源基因被敲除的拟南芥中；分析突变和野生重组目的蛋白在相应磷酸激酶催化下的磷酸化水平；分析转化植株的表型、碳水化合物含量、目的基因的分子水平、目的蛋白表达量及其S-153磷酸化水平、酶活性；以期在理论上探讨单子叶SPS D家族光暗调控位点磷酸化调控机制，实践应用上获得改良的SPS D2基因用于高糖基因工程研究。

甘蔗是多年生的重要糖料作物。磷酸合成酶（SPS）是植物糖分代谢过程中一个不可逆的酶，其SPS活性受磷酸化共价修饰调控，并存在三个关键的磷酸话修饰位点，磷酸化修饰后能够明显降低该酶活性。单子叶中存在一个特有的SPSD家族，在该家族中也仅保留一个磷酸化位点——光暗磷酸化位点，但其磷酸化机制尚不清楚，推测定点突变该位点，能够降低SPS磷酸化水平提高酶活性。由于甘蔗属基因组巨大且是异源非整倍体，其基因组序列依然无法在短期内完成。本研究是基于比较基因组学和二代测序技术平台上，对甘蔗主要种间糖分代谢基因进化关系的比较和表达分析，通过定点突变SPS基因转化拟南芥突变体，研究SPS的磷酸化机制，旨在为甘蔗高糖基因工程育种奠定最基础性的分子生物学工作。主要进展如下：.（1）通过与拟南芥、高粱、水稻等植物的比较基因组研究分析，对含有来自SPS家族基因的热带种及割手密种的14个BAC序列进行鉴定，并进一步进行基因组结构和功能注释。结果发现在热带种和割手密种中均含有5个SPS基因，分别命名为SPSA、SPSB、SPSC、SPSD1、SPSD2.在热带种中五个成员的基因组大小为12,481 bp、5,595 bp、5,060 bp、9,313 bp、6,459 bp。对SPS的进化分析发现，SPSD家族基因为单子叶特异性基因，推测SPSA为SPSD家族基因祖先。这是首次对甘蔗的SPS基因家族进行系统的基因组学研究。.2、通过比较基因组研究分析结合基于RNA-seq的EST测序和实验验证，对甘蔗蔗糖磷酸合成酶进行片段化克隆，分析SPS单倍型和SNP。通过RNA-seq分析发现SPSB在蔗糖合成中发挥重要的作用，而SPSA在蔗糖积累中有重要作用，在胁迫处理条件下，SPSD2取代SPSB发挥蔗糖合成功能。.3、以高粱SPS cDNA序列为模板，采用Gateway 克隆技术，对甘蔗SPS家族基因全长cDNA进行同源克隆，瞬时转染烟草，获得其亚细胞定位为细胞膜。.4、对拟南芥转基因进行不同光暗胁迫处理，对SPS酶活和植物体内碳水化合物进行测定，解析甘蔗SPS光暗磷酸化机制，Ser-153是SPSD2家族光暗磷酸化的重要调控位点。.5、通过项目实施，发表论文7篇和英文著作1章，其中SCI 2篇，中文核心4篇，1篇英文著作章节由Wil