甘蔗内生固氮菌作用位点及固氮基因表达特性的研究

Sugarcane is a high biomass crop requiring large amount of nitrogen.Sugarcane is the important economic crop in Guangxi and contributes more than 65% sugar to annual total sugar production in China.Utilization of biological nitrogen fixation would not only reduce nitrogen fertilizer application in sugarcane production but also protect and improve the ecological environment which may promote the sustainable development of sugarcane industry in China. Our previous research indicated that inoculation of diazotrophic endophytes in sugarcane increased nitrogen contents and biomass in sugarcane.However, the active characters of nitrogen diazotrophic endophytes in sugarcane such as localization of biological nitrogen fixation, expression of nitrogen fixing gene and etc are not clear yet. Based on our preliminary results, the present research will be conducted to clone nitrogen fixing gene, nif H isolated from the advantage of nitrogen fixing bacteria in Guangxi sugarcane and the model strain, PAL5, to express the nif H gene in prokaryotic, and to make nitrogen fixation genes antibody for further analysis of nitrogen diazotrophic endophytes localization by fluorescent immunohistochemistry and nitrogenase expression by Western blot. Also the expression of nitrogenase genes in different parts and growth stages of the sugarcane will be analyzed by qRT-PCR, as well as the effects of environment (e.g. nitrogen feitilizer and nitrogen fixing bacteria inoculation) on nitrogenase activities and nitrogenase gene expression. The results of this research will help our understanding the mechanism of the interaction between sugarcane and nitrogen diazotrophic endophytes.

甘蔗是需氮量较大的高生物量作物，是广西最重要的经济作物，也是全国食糖的重要贡献者。充分挖掘甘蔗的生物固氮，减少甘蔗氮肥的施用量，对促进甘蔗的持续发展具有重要意义。本申请项目前期试验表明，接种固氮菌可提高甘蔗的生物量和组织中的氮素含量，但固氮菌在甘蔗体内的固氮特性如生物固氮的位点、固氮基因的时空表达等还不清楚。本项目在前期研究基础上，拟从广西甘蔗体内分离获得的优势固氮菌及模式菌株PAL5中克隆固氮基因，并进行原核表达分析和制备固氮基因抗体；采用荧光免疫组织化学和Western blot技术分析固氮基因在甘蔗体内发生固氮作用的位点及固氮酶的表达；应用qRT-PCR方法，分析固氮基因的时空表达特点；分析不同的环境条件（不同的氮肥处理、不同的固氮菌接种处理和不同的种植时期等）对固氮基因和固氮酶表达的影响。本研究结果将初步揭示固氮菌在甘蔗体内发生固氮的特性，为进一步有效利用甘蔗生物固氮提供理论依据。

甘蔗是需氮量较大的高生物量作物，是广西最重要的经济作物，也是全国食糖的重要贡献者。充分挖掘利用甘蔗的生物固氮，减少氮肥的施用量，对促进甘蔗的持续发展具有重要意义。本项目设计特异引物，从固氮菌DX120E克隆获得了固氮酶（nifH, nifD, nifK）基因的ORF，成功构建了nifH，nifD和nifK基因的原核表达载体pET-nifH，pET-nifD和pET-nifK。在28 ℃条件下，用1.0 mmol/L IPTG诱导获得了预期大小一致的融合蛋白，NIFH、NIFD蛋白以包涵体形式存在，NIFK蛋白以可溶性蛋白存在，并制备获得了nifH基因的多克隆抗体；采用根系浸根的方法，分别用两个不同的固氮菌株接种处理几个不同的甘蔗品种后发现GFP基因标记的接种菌株，可以从根部进入后移动到甘蔗地上部位，并在不同的部位都可检测到固氮基因及固氮酶的表达，说明在甘蔗不同的部位都可发生生物固氮作用。氮肥和甘蔗品种影响甘蔗的生物固氮特性。施氮处理降低了甘蔗叶片内生固氮菌nifH基因表达和内生固氮种类。Western blot方法证明了在各个时期施氮和不施氮处理下三个甘蔗品种的叶片内均存在有nifH铁蛋白，与低氮肥处理相比，施氮处理的甘蔗器官的nifH铁蛋白的相对表达量更高，且在甘蔗生长盛期nifH蛋白相对表达量更高。大田种植的甘蔗Western blot 结果表明在甘蔗生长的各个时期，甘蔗叶片中均可检测到nifH铁蛋白的表达。固氮菌DX120E和XD20都可以有效的促进甘蔗品种地上和地下部分的生长，株高、叶绿素含量的增加，接菌处理提高了甘蔗叶片谷氨酰胺合成酶和硝酸还原酶活性和叶片硝态氮含量，但对不同的甘蔗品种的促生长效应不同。多个菌株对土壤理化特性的影响的研究结果发现接种菌株可提高土壤的养分和重要酶活性，提高细菌总代谢活性，可以调控土壤细菌群落功能多样性。本研究结果将初步揭示了固氮菌在甘蔗体内发生固氮的特性，为进一步有效利用甘蔗生物固氮提供理论依据。