质子泵抑制剂下调ATP6V1A抑制自噬影响胃腺癌多药耐药的机制研究

Chemotherapy Multi-drug resistance of gastric adenocarcinoma is increasingly becoming a serious problem needed to be solved. Whether autophagy plays as a cytoprotective or cytotoxic role in anti-cancer therapy is still undefined. So, it needs to be further investigated if strategy of autophagy suppression might reverse multi-drug resistance and have therapeutic benefit in the clinical treatment of cancer. We have found the widely used Proton Pump Inhibitors will increase cytotoxicity of Cisplatin when combine with it although the mechanism is not yet clear. Autophagy, which is an important compensatory mechanism in endoplasmic reticulum stress, depends on the acidic microenvironment maintained by Vacuolar H+-ATPase on lysosomal membrane. For this reason, we hypothesise that Proton Pump Inhibitors will block the autophagy flux by inhibiting lysosomal ATP6V1A through some kinds of transcriptional regulatory mechanism and disturbing lysosomal acidic microenvironment, induce apoptosis by enhanced endoplasmic reticulum stress finally. This study aimed to explore the follow contents: the transcriptional regulatory mechanism of ATP6V1A, and if proton pump inhibitor might inhibit autophagy flux by targeting ATP6V1A, due to induced cell apoptosis possibly by enhance endoplasmic reticulum stress and by the regulation of IRE1α, PERK, ATF6 in unfolded protein response,and Bel-2, BAX at downstream of this signal path. Our study is designed to demonstrate that Multi-drug resistance of gastric adenocarcinoma cell line to cisplatin will be reversed by Proton Pump Inhibitor as an autophagy inhibitor.

胃癌化疗耐药的问题日益严重并亟待解决。由于自噬在抗肿瘤治疗中是否起着细胞保护作用仍不明确，因此基于抑制自噬逆转化疗耐药的肿瘤治疗策略是否能带来临床受益仍需进一步探究。我们发现临床常用的质子泵抑制剂预处理能增强胃癌对顺铂的敏感性，推测与干预自噬有关。由于自噬依赖溶酶体膜上空泡型质子泵(Vacuolar H+-ATPase)维持的酸性微环境，因此我们推测:质子泵抑制剂是否通过某种转录调控机制下调编码空泡型质子泵V1亚基A结构域的ATP6V1A表达，干扰了溶酶体膜内外酸性微环境而阻断保护性自噬，进而通过内质网应激导致细胞凋亡以达到化疗增敏的目的？本研究通过一系列体内外实验明确：ATP6V1A的转录调控机制，质子抑制剂如何以其为靶点阻断自噬，并经未折叠蛋白反应中IRE1α、PERK、ATF6信号通路启动下游Bcl-2、BAX等凋亡信号促使细胞凋亡，为质子泵抑制剂逆转胃腺癌多药耐药提供理论依据。

胃癌是一种最常见 的恶性肿瘤。质子泵抑制剂 (Proton pump inhibitors, PPI) 作为抑酸药物， 在临床尤其是消化科应用非常 广泛， 是治疗酸相关疾病例如 反流性食管炎 的首选药物。近年来我们发现PPI 在 肿瘤治疗尤其是胃癌的方面具潜在应用价值。 本研究旨在阐 述 PPI 对胃癌细胞生物学行为的影响即潜在机制。CCK8、台盼蓝染色 提示 PPI对于体外肿瘤细胞具有明显的抗肿瘤作用和促凋亡，流式周期分析提示PPI能够使不同p53状态的细胞阻滞于G2/M期。电镜、 免疫荧光及Western blotting等手段明 确PPI对自噬体的形成具有重要作用，并且这种作用依赖于Atg5/Atg7而非 Beclin 1。通过 Q-PCR 分析，我们发现 PPI 处理之后在不同细胞中均有SQSTM1 的 mRNA 升高，并且这种升高是由 Nrf2 这个转录因子介导的。为了避免 mRNA 升高对 SQSTM1 在 PPI 处理下变化原因的探索，我们采用外源性过表达的方式，发现 PPI 处理能够使得外源性的 HA-SQSTM1 升高，考虑到 SQSTM1的降解还依赖于泛素系统，因此这一结果提示 PPI 可能对泛素-蛋白酶体系统有抑制作用。使用 Western blotting 和 Q-PCR 联合分析发现，PPI 能够诱导poly-ubiquitinated proteins 的聚积，并且对 20S 各个亚基的 mRNA 表达水平有不同程度的抑制作用。伴随着 PPI 导致的细胞内蛋白质堆积毒性， Western blotting和 Q-PCR 均提示有未折叠蛋白反应的激活，即内质网应激反应，通过 RNAi 或者抑制剂的方法发现未折叠蛋白反应（即内质网应激）在自噬激活的过程中起重要作用。当采用蛋白合成抑制剂 Cycloheximide (CHX) 或者蛋白合成减缓剂Rapamycin (Rapa) 时，内质网应激反应的程度会有所降低，使 PPI 对细胞的毒性作用丧失。通过 Western blotting 和 Q-PCR 的方法，筛选线粒体 Bcl-2 家族（包括抗凋亡蛋白 Bcl-xl，Bcl-2 和 Mcl-1，以及促凋亡蛋白 BAX，BAK1，Bim，Bik等）中受到 PPI 处理影响的成员，发现 Bcl-xl 有明显的上调。