基于纤维素微纳结构的磷脂酶微反应器构建及其催化机制研究

lysophosphatide is essential to our health. Intensive studies have shown that functions of lysophosphatide are multifold, ubiquitous and fundamental for life. Being natural surfactants of amphiphilic molecules and physiological functions, commercial lysophosphatide are widely used in foods, pharmaceutical, cosmetic, agriculture and other industrial fields. To transform phospholipid into lysophosphatide by phospholipase immobilization is an important means for preparation of high value- added modified phosphatide. However, the reliability designs of phospholipase carriers still quite lack, lead to inactivation, poor stability and low efficiency of immobilized phospholipase. Phospholipase carriers were not perfect, small specific area, poor structure flexibility and hard to be modified freely etc.. Herein, this project is proposed to design novel cellulose materials as the carrier because of their safety and stability, high structure flexibility, adjustable pore size, and easy modified surface. The phospholipase is introduced into the carrier porous by mild methods for constructing the phospholipase micro-reactors with cellulose micro-nano structure. Based on the catalytic hydrolysis of Soybean phospholipid as the main reaction model, according to the selection of reaction system and controlling of reaction time and temperature to explore the catalytic performance of phospholipase micro-reactor. Based on the Process and controlling steps of formation of the tetrahedral intermediate compounds from the triple active center of phospholipase and the substrate, further investigate the form of amino acids ion pair, incubation period of complex and interface reaction sites of the catalytic hydrolysis, combining the theory of molecular docking, revealing the key controlling factors of the reaction and possible targeted catalytic mechanism of the phospholipase micro-reactor, perfecting the technology of phospholipids modification, providing theoretical guidance and foundation to the exploring of new type of phospholipids resources.

溶血磷脂具有重要的生理功能，广泛用于食品、医药等领域，与人类生活息息相关。利用固定化磷脂酶将磷脂转化为溶血磷脂，是磷脂生物转化、制备高附加值磷脂的重要手段，但目前酶载体缺乏理性设计，导致固定化酶易失活，稳定性差、效率低等。本项目针对磷脂酶载体现存的比表面积小、难修饰、结构单一等问题，运用纳米修饰技术，设计安全稳定、结构灵活、孔径可控且表面易修饰的纤维素载体，运用多重吸附、共价接合等方法将酶引入载体，构建基于纤维素微纳结构的磷脂酶微反应器。选择大豆磷脂水解为主要反应模型，根据反应体系的选择、反应时间、温度的调控等探究酶微反应器的催化性能。基于磷脂酶活性中心三元组与底物形成四面体中间复合物的过程与决速因素，进一步判断磷脂酶催化水解磷脂的氨基酸离子对形态、复合体潜伏期及界面反应位点，结合分子对接理论，揭示反应器的关键控制因素与催化作用机制，完善磷脂生物转化技术，为新型磷脂资源的发掘提供理论基础。

磷脂是构成动植物细胞膜的主要成分，参与细胞的代谢和神经细胞的信息传递，在脂肪代谢、神经发育和体内抗氧化等方面发挥重要作用，是重要的生命基础物质,但是天然磷脂含有较多的不饱和脂肪酸，容易氧化，且包含的各成分之间会相互影响，整体的乳化性能较差，这就限制了磷脂的使用范围。溶血磷脂是磷脂的单酰基形式，即磷脂失去一个脂肪酸基团的产物的总称。溶血磷脂在其分子结构中除保留了普通磷脂的亲水、亲油基团外, 又因疏水基团的减少而显著增加了它的亲水性能，在不同温度和pH值下的稳定性远大于普通磷脂，而其独特的锥型分子结构和在三维空间中自由度的增加，使其渗入细胞膜的能力大大增强。溶血磷脂无刺激、无毒副作用、安全性能高、易生物降解、配伍性能好，在食品、医药、农业等领域应用广泛。. 项目申请人在多年生物质载体构建与酶催化水解研究的基础上，采用微纳结构自组装技术，设计具有稳定的三维互穿网络结构、孔径可控、生物相容性好、比表面积大、表面易修饰的纤维素微球。以磁性纳米粒子和羧基含量1.0mmol/g的纤维素纳米纤维为原料构建了具有三维互穿微孔结构的磁性再生纤维素基微球，微球平均粒径500μm，运用多重吸附、交联等温和的方法将磷脂酶引入载体，构建了具备微纳结构的磁性纤维素基磷脂酶微反应器。选择大豆磷脂水解为主要反应模型，根据反应体系的pH、反应温度等的调控探究酶微反应器的催关键控制因素与催化性能，磷脂酶微反应器具有比游离酶更大范围的pH耐受性和耐高温的能力，最佳反应温度高10℃，重复使用次数达11次以上，此外，由于具备超顺磁性，在外部磁场的作用下，微球可以定向移动，便于回收和重复使用，为可回收的磷脂酶微反应器的构建及新型磷脂资源的发掘提供理论基础，对油料资源的深加工利用，开发安全、营养、高值化的脂质产品具有广泛而深远的意义。项目执行期内圆满完成研究任务，发表SCI及中文期刊文章共13篇，超额完成原定4-6篇的任务指标，获批国家发明专利2项。