发作性运动诱发性运动障碍PRRT2突变后的蛋白降解途径及机制

Paroxysmal kinesigenic dyskinesia (PKD) is the most common subtype of paroxysmal dyskinesias, with autosomal dominant inheritance and causative gene of PRRT2. Recent studies demonstrated that the mutant PRRT2 showed a significant reduction or undetectable expression. However, the potential mechanisms underlying PKD remain largely unknown. Our previous in vitro experiments showed that lactacystin (a proteasome inhibitor) intervention could increase the expression of mutant PRRT2 but not wild PRRT2. These findings suggested that the mutant PRRT2 protein may degrade very quickly, probably through ubiquitin-proteasome pathway. Based on our previous study, we will generate both cell transfection and infection models. We will investigate the half-life of mutant PRRT2 protein through CHX intervention, observe the ubiquitination of mutant PRRT2 protein by co-immunoprecipitation, and elucidate the degradation pathway of mutant PRRT2 protein through lactacystin and CHX intervention. We will also investigate the potential E3 ligases which confer to the ubiquitination of PRRT2 protein. Our ultimate aim is to elucidate the pathophysiologic mechanisms of PKD.

发作性运动诱发性运动障碍（PKD）是发作性运动障碍中最常见的一种，呈常染色体显性遗传，致病基因为PRRT2。近来研究表明，PRRT2突变后其蛋白表达量减少或缺失，但PRRT2 突变导致PKD的病理机制迄今不清。我们前期体外实验表明，蛋白酶体抑制剂乳胞素干预后，突变型PRRT2的蛋白表达量明显上调，而野生型PRRT2的蛋白表达量无明显变化，提示PRRT2突变后其蛋白降解增加，很可能是通过泛素-蛋白酶体途径降解。本项目拟在前期研究基础上，建立细胞感染及转染两种模型，利用CHX干预探讨PRRT2突变后蛋白的半衰期改变；利用免疫共沉淀研究PRRT2突变后蛋白的泛素化修饰；利用乳胞素和MG-132干预明确PRRT2突变后蛋白的降解途径及机制；并探讨PRRT2蛋白泛素化的E3连接酶，初步阐明PKD的发病机制。

发作性运动诱发性运动障碍（paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD）是发作性运动障碍中最常见的一种，呈常染色体显性遗传，致病基因为PRRT2。近来研究表明，PRRT2突变后其蛋白表达量减少或缺失，但PRRT2突变导致PKD的病理机制迄今不清。本项目拟利用CHX干预探讨PRRT2突变后蛋白的半衰期改变；利用免疫共沉淀研究PRRT2突变后蛋白的泛素化修饰；利用乳胞素和MG-132干预明确PRRT2突变后蛋白的降解途径及机制；并探讨PRRT2蛋白泛素化的E3连接酶，初步阐明PKD的发病机制。我们成功构建野生型及5种突变型PRRT2表达质粒，转染细胞，发现PRRT2突变后蛋白表达量减少或缺失，但PRRT2 mRNA无显著性差异，提示PRRT2蛋白减少并非通过无义突变介导的mRNA降解(NMD)机制导致转录减少。利用CHX干预，我们发现突变型PRRT2蛋白的半衰期缩短。利用蛋白酶体抑制剂乳胞素及MG-132干预，发现野生型PRRT2蛋白表达变化不明显，而突变型PRRT2蛋白表达量增加，提示突变型PRRT2蛋白可能通过泛素蛋白酶体途径降解。通过免疫共沉淀及质谱分析，发现了3个具有E3连接酶功能的蛋白（AMFR，HSPA2，HSPA8），并发现AMFR蛋白与PRRT2的泛素化修饰有关。成功构建29种PRRT2错义突变质粒，功能研究提示12种突变会影响蛋白的表达量，13种突变会影响蛋白的亚细胞定位，对错义突变的致病性提供实验依据。我们在121例PKD先证者中进行基因筛查，发现了21种PRRT2突变，其中9种为新突变，基因型表型关系提示携带PRRT2突变的PKD患者起病年龄更早、舞蹈样动作和双侧发作更多、发作时间更长、更容易合并癫痫、婴儿惊厥，偏头痛等，但对卡马西平反应更好。我们计算出PRRT2突变的外显率为72.09%。我们通过功能性核磁共振（fMRI）探讨PKD患者的大脑超微结构改变，发现PKD患者的左侧大脑半球皮质脊髓束的平均扩散率明显下降，辅助运动前区和额下回岛盖部的灰质容积较正常对照明显减少。多元线性回归分析提示，PKD患者的大脑白质及灰质改变与患者的年龄、PRRT2突变无明显相关性，但与病程显著相关。