TRAIL与IER3相互作用调控Wnt/β-catenin/WISP1促进肝癌细胞凋亡的分子机理研究

The ability of TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) to induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells has been widely demonstrated, but its specific intracellular mechanism is not well defined. Combined with Co-IP and LC-MS/MS, the interaction between TRAIL and IER3 was identified for the first time by our group. Of the Wnt signaling pathway array kit, WISP1 showing a significate downregulation by TRAIL and IER3 treatment. We proposed the hypothesis: TRAIL and IER3 induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by regulating Wnt/β-catenin/WISP1 signaling pathway. To test this hypothesis, we established human hepatoma cell lines and animal models of hepatocellular carcinoma in nude mice to investigate the function of WISP1 in HCC apoptosis. Real time PCR, Western blot, FACS, over-expression and RNA interference were examined to explore the important role of WISP1 in the TRAIL and IER3 treatment groups through the molecular, cellular, tissue and animal levels. Our study provides evidence that TRAIL and IER3 exerted apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by modulating Wnt/β-catenin/WISP1 signaling. It is opening up a new theory and experimental mechanism for the prevention and treatment of HCC.

可溶性的TRAIL能够诱导肝癌细胞的凋亡，但是其在细胞内的具体作用机制却知之甚少。本课题组利用Co-IP结合LC-MS/MS首次发现可溶性TRAIL与IER3存在相互作用，采用Wnt信号通路试剂盒，筛选出TRAIL与IER3下调WISP1的表达，为此我们提出假说：TRAIL与IER3协同作用诱导肝癌细胞凋亡，其生物学效应是通过调控Wnt/β-catenin/WISP1信号通路实现的。为了验证这一假说，我们以人肝癌细胞系和裸鼠肝癌动物模型为研究对象，采用Real time PCR、Western blot、FACS、过表达和RNA干扰等手段，从分子、细胞、组织以及动物水平探讨WISP1在TRAIL与IER3介导的肝癌细胞凋亡中的重要作用，明确TRAIL与IER3通过Wnt/β-catenin/WISP1信号通路促进肝癌细胞凋亡的调控机制，为肝癌的预防治疗提供新的理论和实验依据。

原发性肝癌（简称肝癌）是临床上最常见的恶性肿瘤之一，全世界范围内统计其发病率占全身肿瘤的第5位，死亡率占全身肿瘤的第3位。肝癌的发生进展与肝癌细胞的凋亡抵抗密切相关，因此对参与肝癌细胞凋亡调控因子功能进行相关研究，对于研究肝癌的发生机制以及治疗靶标的筛选具有重要的意义。Co-IP结合LC-MS-MS，是近年来发展出来的一种能够快速研究在生理条件下蛋白质相互作用，揭示蛋白质复合体相互作用网络的新技术，已成为研究蛋白质组学的一个重要工具。随着该技术的不断完善，它在认识蛋白质相互作用的过程中必将发挥越来越重要的作用。.实验方法：将TRAIL真核表达载体转染到SMMC7721细胞系，采用Co-IP结合LC-MS-MS鉴定与TRAIL相互作用分子，利用GST pulldown，Co-IP，免疫荧光鉴定两者的相互作用；采用real time PCR、Western blot、FACS、激光共聚焦（LSCM）、裸鼠成瘤、免疫组化等实验技术观察TRAIL和IER3协同作用对肝癌细胞体外、体内凋亡的影响。.实验结果：利用Co-IP结合LC-MS-MS技术鉴定出了与TRAIL相互作用的蛋白IER3；采用GST pulldown，Co-IP验证了TRAIL与IER3的直接相互作用；采用MTT、FACS、Transwell等实验，证明TRAIL与IER3协同作用在体外能够诱导肝癌细胞的凋亡；建立了肝癌裸鼠动物模型，计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，表明TRAIL与IER3协同治疗组明显抑制肝癌的生长。.实验结论：本研究表明TRAIL/IER3能够在体内外直接相互作用，并能够明显抑制肝癌细胞的生长，诱导肝癌细胞的凋亡。