肿瘤上皮及其肿瘤交界处间质细胞microRNA的表达和早期大肠癌预后的相关性验证及功能研究

This study aims to investigate association of microRNA expression in tumor epithelial cells and interface zone stromal cells with prognosis of early colorectal cancer (stage I and II) for identifying new molecular markers of colorectal cancer. In our previous study, we applied laser capture microdissection to isolate both carcinoma epithelial cells and interface zone stromal cells in 8 colorectal surgical tissues from patients (4 died and 4 survival in 5 years) with early stages of colorectal carcinomas. We then performed the microarray analysis and identified the significant association of 19 microRNAs with the prognosis of early stage colorectal carcinomas (fold change > 2 fold and p < 0.05). Those microRNAs are the candidate biomarkers for further validation. In this research proposal, we will perform quantitative RT-PCR to validate the 19 microRNA candidates in an independent cohort of macrodissected FFPE colorectal tissues from 100 patients with stage I and II colorectal carcinomas. We will evaluate the performance of the candidates in the prediction of the tumor metastasis and disease free survival. Furthermore, we will perform the functional study to determine the role of the validated microRNAs on proliferation, apoptosis, evasion and migration effect to the colorectal tumor cells, and on the cell mocelular phenotype changes to the interface zone fibroblasts. The main contribution of this proposed research is to establish a panel of validated microRNA biomarkers for predicting the prognosis of early stage colorectal carcinomas. Moreover, the functional microRNA study may shed the light on the mechanism of tumor progression and metastasis for new drug development.

分期相同、不同病例间的大肠癌预后差别很大，用现有技术难以预测。本项目旨在对肿瘤上皮及肿瘤交界处间质细胞microRNA的表达和早期大肠癌预后的相关性进行验证，并研究其功能。我们已通过激光捕获显微切割技术从8例预后不同的大肠癌组织中分离纯净肿瘤上皮及肿瘤交界处间质细胞，并进行microRNA芯片分析，筛选出19个尚未见报道的与早期大肠癌预后相关的microRNA，建立了microRNA功能研究平台。本研究拟通过RT-qPCR验证这19个microRNA在100例早期大肠癌肿瘤上皮及肿瘤交界处间质细胞中的表达；建立并验证可预测早期大肠癌预后的数学模型；共培养原代肿瘤交界处成纤维细胞和大肠癌细胞系，体内外检测候选microRNA对前者细胞表型改变的作用；对后者生物学功能的影响。最终为早期大肠癌预后预测提供新的分子标志物及理论依据，为早期大肠癌的治疗提供潜在靶点。

早期大肠癌生存率相对较好，但仍有26% I期和40%的II期大肠癌患者最后死于复发或转移。病理分化程度和分期相同的大肠癌患者采用相同的化疗方案后为什么会出现明显差异的治疗反应？可见大肠癌患者的预后存在明显的个体差异。而常规的组织学手段所提供的信息量有限，不足以正确、及时地认识肿瘤发生发展过程中分子水平的病理改变及基本规律，更无法判断是否有远处转移的潜能。因此，对于早期非转移大肠癌的分子表型研究有助于更准确地对大肠癌进行分子分型及预后判断，有效地提高靶向治疗的效率。本课题旨在筛选和验证与早期大肠癌预后相关的肿瘤上皮细胞和交界处间质的miRNA及血浆中表达，并进一步探讨候选miRNA的功能学改变，为早期肠癌的预后预测提供新的分子标志物，为治疗提供新的可能靶点。通过96例具有5年生存率的石蜡样本的检测和验证，我们发现在肿瘤上皮细胞和交界处间质细胞中都存在和预后相关的差异表达的miRNA。其中当miR-27b、miR-650和let-7a以一定数学模型组合时，判断早期肠癌预后的AUC值达到0.832，敏感性为65.0%，特异性为68.2%，准确度为66.7%。miR-650作为独立预后标记物时，其高表达的患者手术切除18个月后的生存率明显高于miR-650低表达的患者(p=0.005,HR=4.12)。交界处间质细胞中miR-224高表达的患者生存率存在优于miR-224低表达的患者生存率的趋势(p=0.079,HR=3.52)。并发现一组血浆miRNA可以筛查早期大肠癌(AUC 0.90)。功能学实验发现：与对照组相比，稳定表达pre- miR-650的细胞株的生长显著受抑制(抑制率21.0%,p=0.045)，侵袭能力显著受抑制(抑制率40.4%,p=0.008)，迁移能力显著受抑制(抑制率39.6%,p=0.01)。 移植瘤模型中，miR-650能抑制皮下移植瘤的生长(抑制率34.5%,p=0.05)。在原位种植瘤模型中，miR-650能抑制肿瘤细胞向组织深处浸润并能抑制瘤栓的形成。以上结果表明：在早期非转移性大肠癌的肿瘤上皮细胞和交界处间质细胞中都存在与预后相关的差异表达的miRNA。其中miRNA-650可作为独立的预后因子，其表达水平与生存时间呈正相关。并且miRNA-650可在体内外抑制大肠癌的生长和浸润，有望成为早期非转移性大肠癌预后标记物及潜在的药物靶点。