驴皮伤口无瘢痕化愈合过程中胶原蛋白沉积的调控机制研究

The over deposition and of collagen and the imbalance of type I/III collagen are the main factor of scar formation during skin wound healing. The donkey’s hide, which is unique production material for Ejiao, has strong ability for collagen synthesis. But our preivious study found that the donkey hide is scarless wound healing, and the wound healing ability is unrelated with donkey age. These phenomena may due to the regulation of collagen deposition by some candidate genes and proteins.. In the project, different wound stage of 6-7 years old Xinjiang donkey back skin will be collected. Fristly, by qRT-PCR, Western blot and immunohistochemistry, it was detected that the change regularity of the expression and the ratio of type I and III collagen in the donkey skin with normal skin as control. Secondly, the differentially expressed genes and proteins were screened by the transcriptome and proteome analysis, and the functional relationship was analyzed between them by bioinformatics. Finally, the regulation role of these genes on collagen deposition was verficated in the donkey dermal cells cultured in vitro, using gene over expression and silencing. Our study aims to explain the molecular regulation mechanism of scarless wound healing in donkey skin, and provide reference evidence for the scarless treatment of human wound.

皮肤伤口愈合时，胶原蛋白的过量沉积、Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的比例失调是造成伤口瘢痕愈合的主要因素。而驴皮作为生产阿胶的唯一原料，其合成胶原蛋白的能力极强，但我们前期研究发现，驴皮伤口自然愈合时却不会产生瘢痕，且伤口愈合的能力与驴的年龄无关。这可能是某些基因与蛋白共同调控其胶原蛋白沉积的结果。. 本项目将采集6-7岁新疆驴背部伤口愈合不同时期的皮肤组织，以正常驴皮为对照，首先采用qRT-PCR、Western blot、免疫组化技术，研究驴皮中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达量及比值的变化规律；然后分别经转录组、蛋白组分析，筛选驴皮伤口愈合不同时期差异表达的基因与蛋白，并经生物信息学联合分析两者间的功能关系；最后在体外培养的驴真皮细胞中，使用基因过表达和沉默技术，验证这些基因对胶原蛋白沉积的调控作用，明确调控驴皮伤口组织无伤痕化愈合的分子网络机制，为人类皮肤伤口的无瘢痕治疗提供参考依据。

本项目采集了新疆驴皮肤伤口不同愈合期0、7、17、105天（对照组、炎症期、肉芽期、重塑期）的真皮组织。（1）经转录组、蛋白组生物信息学联合分析、筛选驴皮伤口愈合不同时期差异表达的基因与蛋白。（2）体外培养驴皮肤成纤维细胞并进行细胞鉴定，用添加了高、中、低浓度组硫酸钠、5-FU培养液检测对细胞增殖率、凋亡率以及合成胶原蛋白的相关基因表达量的影响。（3）分别于驴皮创伤后0 d、7 d、17 d、100 d计算创面愈合率，观察创面组织学变化以及胶原纤维的增生情况，检测TGF-β信号通路中部分关键基因在驴皮肤伤口内的表达差异。（4）分离培养驴外周血中的巨噬细胞，用含不同浓度的紫草素、LPS培养液刺激巨噬细胞，并检测炎症因子在细胞中的表达；在驴皮伤口表面涂抹紫草素、LPS凝胶，观察伤口愈合情况，并检测驴皮伤口愈合相关基因和及蛋白的表达水平。.结果表明：（1）驴皮伤口组织表达的基因数为28,504，其中已知基因为28,116个，预测的新基因为388个；上调蛋白总共1071个，两组织间平均178个；下调蛋白317个，平均53个；与胶原蛋白分泌合成的PI3K-AKT信号通路、TGFβ/smad信号通路对驴皮伤口的愈合可能起到关键调控作用。（2）250μg/mL硫酸钠培养液培养驴皮肤成纤维细胞48 h，能显著提高细胞增殖率，促进细胞信号通路相关基因合成胶原蛋白；100μg/mL 5-FU 培养24 h，可有效抑制成纤维细胞的增殖，抑制细胞信号通路相关基因合成胶原蛋白。（3）驴皮伤口外敷硫酸钠可加快伤口愈合的速度，缩短肉芽期伤口愈合的时间，但愈合后形成瘢痕疙瘩，上调TGF-β/smad信号通路相关基因mRNA相对表达量及蛋白浓度；驴皮伤口注射5-FU，可延长肉芽期伤口愈合的时间，但愈合后不形成瘢痕疙瘩。（4）成功分离了驴外周血中的巨噬细胞，用含10 %的自制驴血清培养液培养其效果更佳；并用1.0 mg/L的LPS、10.0 μmol/L的紫草素对细胞的促炎效果均较好；涂抹LPS凝胶对驴皮组织和机体具有一定的促进炎症的作用，能减缓伤口的愈合速度，但减少了瘢痕的形成，而紫草素凝胶的作用反之。