线粒体自噬在褐飞虱适应抗性水稻中的作用及其机制研究

The brown planthopper (BPH) Nilaparvata lugens is a major insect pest of rice crops, and the largely variable virulence of BPH challenges the sustainable use of resistant rice varieties. So far, the mechanism for virulence variation of BPH hasn’t been clarified yet. Previously, we found that genes and signaling pathways related to mitophagy were induced during the BPH getting adapted to the resistant rice, but the functional mechanism of mitophagy still remained unclear. In this study, we will clone key genes in mitophagy pathway firstly, and then study the expression pattern of these genes in order to set up the relation between mitophagy and BPH getting adapted to resistant rice, by using methods of qPCR, Western blot, and TEM, etc. Furthermore, by regulating the signaling pathway with inhibitor/inducer, or RNAi of key genes, we try to study the effect of inhibition/induction of mitophagy pathway on BPH getting adapted to resistant rice, and reveal the exact function of mitophagy. At last, the regulating mechanism of mitophagy in BPH will be studied at individual level and cellular level, respectively, including the effect of signals from the host or nutrition on mitophagy pathway, regulating effect of Akt-TOR pathway upstream on mitophagy, and aggregation mechanism of autophagic-related protein. We aim to demonstrate that mitophagy plays an important role in BPH getting adapted to resistant rice, and identify some key genes, in order to provide new idea and new target for controlling BPH.

褐飞虱是重要的水稻害虫，其快速可变的致害性对水稻抗性品种的可持续利用构成巨大威胁。褐飞虱对抗性水稻的适应机制至今未能阐明。我们的研究发现褐飞虱适应抗性水稻的过程伴随线粒体自噬的激活，推测褐飞虱可能通过线粒体自噬的方式对抗性水稻产生适应，但具体作用及机制尚不清楚。本项目首先通过克隆线粒体自噬通路的重要基因，运用qPCR、Western blot、电镜等技术研究线粒体自噬的发生规律；然后，通过自噬通路关键基因的RNA干扰、通路抑制剂/诱导剂等处理，考察自噬的抑制或诱导对褐飞虱适应抗性水稻的影响，明确线粒体自噬的作用；最后，分别从个体和细胞水平，研究寄主相关信号或营养对线粒体自噬的影响、上游Akt-TOR等通路对自噬的调控作用、自噬复合体的招募机制等，以探明线粒体自噬的调控机制。本项目旨在证实我们提出的褐飞虱通过线粒体自噬适应抗性水稻的假说，并鉴定出关键调控基因，为褐飞虱防治提供新思路和新靶点。

褐飞虱是重要的水稻害虫。本项目根据褐飞虱转录组和基因组信息，克隆到ATG1、ATG3、ATG4、ATG5、ATG6、ATG8 等10多个线粒体自噬相关基因的全长cDNA。根据全长cDNA信息预测翻译蛋白的氨基酸序列，设计合成了用于制备一抗的多肽片段，进而制备了相应基因的一抗。采用荧光定量PCR技术，分别研究了10多个自噬相关基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织部位等的表达规律。其中，NlATG1在褐飞虱的不同发育阶段均有表达，在若虫中表达量较高，而在雌、雄成虫中表达量均较低。在褐飞虱5龄若虫中，NlATG1在头部、中肠、卵巢和脂肪体中表达水平较高，而在胸部的表达水平最低。结合电镜和激光共聚焦技术对自噬发生情况进行了验证，探明了基础自噬发生的特点和规律。比较了不同抗性水稻饲养的褐飞虱细胞自噬情况，发现褐飞虱与抗性水稻互作过程中自噬相关基因会出现短时应激上调，但是抗性水稻可以最终抑制褐飞虱的细胞自噬，诱导细胞凋亡，探明了细胞自噬在褐飞虱与抗性水稻互作中的发生规律。采用转录组技术分析了ATG5基因RNA干扰前后褐飞虱转录组的变化，研究了ATG5基因RNA干扰的靶标特异性及脱靶效应，明确RNA干扰具有良好的特异性，适于本项目的基因功能研究。通过饥饿、在褐飞虱人工饲料中添加自噬抑制剂3-MA/诱导剂Rapamycin、以及对自噬通路的关键基因进行RNA干扰等处理，实现了对线粒体自噬的诱导或抑制，研究了褐飞虱线粒体自噬的调控机制。通过RNA干扰技术，研究了ATG1、ATG3等关键基因对褐飞虱生长发育、生存和生殖等的影响。其中，NlATG3的RNAi对褐飞虱若虫有很强的致死作用。用dsNlATG3处理4龄若虫，所有个体在3天内死亡，没有个体成功蜕皮。当dsNlATG3处理的雌虫与dsGFP 处理的雄虫交配后，与对照组合dsGFP♀dsGFP♂相比，单雌产卵量减少80.4%，卵的孵化率从95.7% 降低为0。上述结果表明，自噬相关基因在褐飞虱防治中具有潜在的应用价值。