双细胞膜片复合表面修饰的珊瑚羟基磷灰石构建血管化组织工程骨的研究

The treatment of massive bone defects is difficult problems and enormous challenges of modern medicine. However, the technique of bone tissue engineering has had some success. Among the rest, how to establish an effective blood supply and build timely vascularized bone has already become a key issue in bone tissue engineering. In this study, based on the ideas of optimal design of materials and technology of stem cells and cell sheets, the ideas and methods of building vascularized tissue engineered bone (TEB) will be explored. Coralline hydroxyapatite/polylysine composite scaffolds will be prepared and scanning electron microscope, X-ray diffraction, Fourier transform infrared spectroscopy, and mechanical testing will be used for characterization. The adipose-derived stem cells of goat will be bi-induced to obtain osteoblast cell sheets and endothelial cell sheets. Then, vascularized TEB with and without scaffolds will be prepared by two cell sheets/scaffolds and the two cell sheets alone. The ability of ectopic osteogenesis and revascularization of the vascularized TEB will be evaluated by implanting them in nude mice subcutaneously. Finally, the vascularized TEB with and without scaffolds will be implanted in goat tibia defects to observe the vascularization and bone repair. The study will serve as a foundation for further study of developing a new vascularized TEB for bone repair application and the therapy of massive bone defects.

大块骨缺损的治疗是现代医学面临的难题和巨大挑战,而骨组织工程学为解决这一难题带来了希望。其中，如何建立有效的血液供应,构建能及时血管化的组织工程骨是目前骨组织工程研究的一个重要方向。本研究基于申请人对骨组织工程的前期基础研究优势，依据材料优化设计的思想，借鉴干细胞及细胞膜片技术，探讨复合构建创新性的血管化组织工程骨的思路和方法。研究将珊瑚羟基磷灰石与多聚赖氨酸复合制备一种新型的复合支架，并对其表面形貌、理化性能等进行表征。然后,利用山羊的脂肪干细胞行双向诱导，获得成骨细胞膜片和内皮细胞膜片;将双膜片单独或与支架复合分别构建无外源支架和有外源支架的血管化组织工程骨，将其植入裸鼠背部皮下，检测其异位成骨的能力和对血管再生的影响。最后，将无和有外源支架大块血管化组织工程骨植入山羊胫骨缺损处，观察血管化和骨修复的情况，以期为理想的血管化组织工程骨的开发及大块骨缺损的再生治疗提供实验基础和理论依据。

研究通过真空冷冻干燥法制备了六组多聚赖氨酸（polylysine，PLL）修饰的珊瑚羟基磷灰石（coraline hydroxyapatite，CHA）复合支架(分别为CHA支架、0.25% PLL-CHA支架、0.5% PLL-CHA支架、0.75% PLL-CHA支架、1.0% PLL-CHA支架、1.25% PLL-CHA支架)。扫描电子显微镜显示经PLL修饰后CHA表面粗糙度发生变化，但随PLL质量分数增加其平整度、表面附着颗粒大小的变化无明显规律。五组PLL-CHA支架的红外光谱曲线、X-射线衍射图与纯CHA支架十分相似。将兔脂肪间充质干细胞接种于PLL-CHA复合支架上后显示，0.25% PLL-CHA组细胞增殖最优，0.25% PLL-CHA组ALP活性在上升期处于较高水平，表明PLL可有效促进细胞粘附、增殖和分化，且0.25%为PLL最佳质量分数。大鼠脂肪间充质干细胞可以定向分化为成骨细胞，持续诱导培养后可获得成骨细胞膜片，且该膜片可能具有潜在的成骨能力。大鼠脂肪间充质干细胞可以定向分化为内皮细胞，持续诱导培养后可获得内皮细胞膜片，且该膜片可能具有潜在的成血管能力。兔脂肪间充质干细胞可定向诱导分化为成骨细胞，持续诱导培养后可获得具有成骨潜能的成骨细胞膜片。兔脂肪间充质干细胞可定向诱导分化为内皮细胞，持续诱导培养后可获得成血管潜能的内皮细胞膜片。兔双细胞膜片复合体（Double cell sheet，DCS）具备一定成骨、成血管性能。将成骨、成血管内皮细胞膜片复合可产生协同效应，增强成骨，成血管性能。结果显示：以成骨细胞膜片在下、内皮细胞膜片在上的构建方式得到的组织成骨、成血管状况最佳。珊瑚羟基磷灰石支架与双细胞膜片复合构建的有外源支架的血管化组织工程骨具有一定的成骨、成血管性能，并且珊瑚羟基磷灰石可有效提高双细胞膜片复合体成骨性能。其中以内皮细胞膜片在内，成骨细胞膜片在外方式构建得到的人工组织血管化、矿化程度最佳。DCS-PLL-CHA移植物修复兔桡骨大段骨缺损的结果显示，自体骨组修复效果最佳，其次为DCS-PLL-CHA组，CHA组修复效果最差。DCS复合体与PLL-CHA复合构建的预血管化组织工程骨具备较好的骨再生和骨重建潜能，可以用来修复大段骨缺损。