小麦抗纹枯病相关蛋白激酶基因TaPK-R1的克隆、功能与作用机制研究

Wheat sharp eyespot disease, primarily caused by the fungal pathogen Rhizoctonia cerealis, is threatening wheat production in China.It is very necessary and urgent for the disease resistant wheat breeding to study wheat defense mechanism to sharp eyespot, to identify and clone important resistance-related genes, and to develop effectively functional markers for molecualar-assistant selection of the sharp eyespot resistance..Through using Genechip and RNA-sequencing techniques and virus-induced gene silencing analysis, a new wheat gene encoding a protein kinase, temporally named TaPK-R1, was identified to be involved in the wheat resistance response to the disease pathogen Rhizoctonia cerealis..In this project, we plan to perform the following researches: to isolate the full-length sequences of the gene TaPK-R1 and its related promoters from different resistant and susceptible wheat cultivars, to mine excellently allele variation of TaRLK5 in wheat cultivars,to develop a functional marker;to study the biological function of TaPK-R1 in wheat through transgenic plants overexpressing and underexpressing (RNA interference) TaPK-R1 and genetic linkage mapping; to study the mechanism underlying TaPK-R1 using the above transgenic and wild-type wheat plants as materials and by study of genes regulated by TaPK-R1 and interacting proteins with TaPK-R1 protein.The project will provide a theorical basis, a resistant gene resource, a functional marker and a technical assistance for wheat breeding with resistance against sharp eyespot.

小麦纹枯病是难以防治的我国小麦生产上第一大土传病害。小麦纹枯病抗性遗传方式复杂，抗性鉴定和选择困难，致使我国小麦品种对纹枯病抗性普遍较差。加强小麦抗纹枯病分子生物学研究，发掘、克隆抗纹枯病重要基因，开发功能标记，培育抗纹枯病小麦新品种，十分必要和迫切。.本项目组前期利用转录学技术，开展了抗纹枯病小麦与感病小麦间差异基因表达谱的全面分析，结合VIGS功能初步分析，鉴定出1个小麦抗纹枯病相关蛋白激酶新基因TaPK-R1。.本项目将从不同抗、感纹枯病小麦中，克隆小麦TaPK-R1基因全长序列及其启动子序列，发掘优异等位基因变异，开发功能标记；通过转基因、分子检测、表型鉴定与遗传连锁分析等，深入系统地研究TaPK-R1在小麦中生物学功能，明确该基因对小麦纹枯病抗性的贡献率；研究TaPK-R1的表达特性、蛋白质生化特性和作用机制，为小麦抗纹枯病遗传育种提供理论依据、优异基因、功能标记和技术支撑。

小麦纹枯病是难以防治的我国小麦生产上第一大土传病害。本项目利用比较转录学结合 VIGS功能初步分析，分离克隆出 1 个小麦抗纹枯病相关蛋白激酶新基因TaPK-R1(GenBank accession KJ686386)， 编码由557个氨基酸组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于AGC激酶类（根据国外审稿专家和杂志编辑建议，TaPK-R1重新命名为TaAGC1）。克隆出不同抗纹枯病小麦、感纹枯病小麦品种中TaPK-R1基因的编码序列、基因组序列和非编码序列，序列比对结果表明，抗纹枯病小麦CI12633、山红麦与感病小麦温麦6号中TaPK-R1基因的ORF序列完全相同，在抗病与感病小麦中该基因3’UTR和启动子序列部分间存在SNP的差异，但这些SNP差异与小麦品种的纹枯病抗性间无密切的相关性。将TaPK-R1基因定位于小麦染色体3B上。明确了TaPK-R1的时空表达特性：TaPK-R1表达量在CI12633茎部最高，并受纹枯病菌诱导；接种该病原菌4天和21天，TaPK-R1在抗纹枯病小麦中的表达量明显高于在感纹枯病小麦中表达量，初步说明该基因参与了小麦对纹枯病菌的抗病反应。研究了该蛋白的生化特性，明确了TaPK-R1/ TaAGC1定位在胞质膜上与细胞核中，TaPK-R1/ TaAGC1具有蛋白激酶的自激活和激活特性，且发现该蛋白的Asp-239是其蛋白激酶活性必需的位点；通过VIGS、转基因和分子特征分析等技术，对TaPK-R1基因沉默和基因过表达的小麦植株进行功能和作用机制分析，结果表明TaPK-R1通过调控活性氧的平衡态和防御相关基因表达，进而正向调控小麦对纹枯病抗性和耐冻性反应。该研究首次阐明单子叶植物-小麦中1个AGC酶可以正向贡献于寄主对腐生真菌的抗病防御反应，为抗纹枯病的小麦改良提供了基因资源、理论依据和技术支撑。发表相关SCI文章4篇，1篇EI文章(The CROP Journal 2014)，1篇核心刊物文章（作物学报，2016)，申请并获得授权的国家发明专利1项。参加国际学术会议2次，做分组报告发言和学术交流。邀请国外4个同行科学家来华进行学术交流。