酸敏感离子通道在慢性吗啡引起的痛觉超敏中的作用及机制

Morphine-induced hyperalgesia is a great challenge for pain specialists, but little is knowm about the mechanism. Recent studies and the existing literature suggest acid-sensing ion channels (ASICs) participate in hyperalgesia induced by inflammation. The effect and mechanism of ASICs in hyperalgesia induced by morphine treatment have not been explored. Substantial earlier evidence indicates that chronic morphine treatment upregulates the activity of protein kinase A (PKA) or protein kinase C (PKC). Other studies show that there are some PKA or PKC phosphorylation sites in ASICs. Furthermore, the phosphorylation can result in plastic functional changes of ASICs. Howerver, the existing studies just focused on the quantitive change of ASICs in hyperalgesia. Therefor, we hypothesize that chronic morphine treatment upregulates the activity of PKA or PKC which phosphorylates the ASICs , by which induces hyperalgesia. We will use behavioral testing, whole cell patch clamp, a highly selective siRNA (small interfering RNA) knock-down method, protein kinase assay, Western blot, and Real-time PCR to explore the role and mechanism of ASICs in morphine-induced hyperalgesia. The results will provide new insight into how to control the morphine-induced hyperalgesia and devise treatment plans for patients under chronic morphine treatment.

吗啡引起的痛觉超敏是临床医生面临的一个非常棘手的问题，但是其机制未明。近年的研究表明，酸敏感离子通道（ASICs）在炎症刺激引起的痛觉超敏中起重要作用。但是并不知道该通道在吗啡引起的痛觉超敏中是否起同样重要的作用。以往有大量研究发现，吗啡慢性处理可以上调PKA和PKC的活性。另有研究表明，ASICs结构上面存在PKA和PKC的磷酸化位点，而且这些位点的磷酸化修饰可以引起ASICs功能的重塑。因此，我们提出下面的工作假说"吗啡慢性作用上调蛋白激酶A或者蛋白激酶C的活性，对ASICs进行磷酸化修饰，使其对酸刺激的反应性和敏感性增强，最终引起痛觉超敏"。我们拟采用动物行为学测定、全细胞膜片钳记录、RNA干扰、蛋白激酶活性测定、Western blot和Real-time PCR等技术，重点从ASICs功能变化的角度去开展研究。本研究有望为吗啡副作用的防治提供新思路和新靶点。

PartⅠ 吗啡长期使用会引起痛觉超敏。而关于慢性吗啡处理引起痛觉超敏的分子机制并不清楚。酸敏感离子通道（acid-sensing ion channel, ASIC）是一类由质子门控的、非电压依赖的阳离子通道。研究发现ASIC跟疼痛信息的处理和慢性炎症引起的痛觉超敏密切相关。但是，吗啡慢性处理是否会通过调节ASIC的表达来介导痛觉超敏的发生还不得而知。因此，我们采用western blot和PCR技术分别研究了吗啡慢性处理对ASIC在脊髓（Spinal cord）、延髓头端腹外侧区（Rosrtral ventrolateral medulla, RVM）和杏仁核（Amygdala, Amy）表达的影响。结果表明，无论是在蛋白质水平，还是mRNA水平，吗啡都不改变ASIC1和ASIC3在Spinal cord、RVM和Amy的表达。说明慢性吗啡处理不会通过改变ASIC1和ASIC3的表达水平来介导吗啡痛觉超敏的发生。.PartⅡ 吗啡长期使用会引起痛觉超敏。慢性吗啡处理引起的细胞内钙增加是痛觉超敏的重要分子基础。但是，吗啡慢性处理引起细胞内钙增加的机制并不清楚。电压门控钙通道（Voltage-gated calcium channel, VGCC）负责调控细胞外钙向细胞内流动。大量研究表明，VGCC跟疼痛信息的处理和炎症引起的痛觉超敏密切相关。但是，吗啡慢性处理是否通过对VGCC进行调控从而导致痛觉超敏的发生还不得而知。因此，本课题综合采用了行为学（热板实验）、脑片全细胞膜片钳技术、western blot和PCR方法研究了VGCC在吗啡引起的痛觉超敏中的作用和机制。行为学研究表明，吗啡慢性处理（吗啡腹腔注射，每次5 mg/kg，每天两次，连续六天）引起了热痛觉超敏。腹腔内注射L型钙通道阻断剂nifedipine（20 mg/kg）显著削弱了吗啡引起的热痛觉超敏。说明VGCC活动增强是吗啡慢性处理引起痛觉超敏的重要原因，VGCC活动增强是吗啡慢性处理的结果。进一步研究发现，吗啡慢性处理通过上调α1C亚基蛋白在RVM的表达导致VGCC电流显著增加最终引起痛觉超敏的发生。本研究提示我们α1C亚基将是开发抗痛觉超敏药物的一个重要靶点。