巴泰病毒通过网格蛋白介导的内吞途径入侵N2a细胞机制研究

In recent years, emerging and re-emerging infectious diseases including Batai virus disease have threated seriously to human and animal. And Batai virus transmitted to humans and livestock by mosquitoes, which mainly resulted in non-specific fever, even aseptic meningitis in human. And livestock showed abortion and neurological symptoms. In 2012, we have isolated a novel BATV NM/12 strain from bovine serum collected in Inner Mongolia, which was firstly reported in China. Because the lack of research on Batai virus, the process of virus infection is not clear in cell, and the mechanism of BATV entry N2a cell is still unknown. Therefore, we study on the BATV entry into N2a cells by clathrin-mediated endocytosis. CPZ, Dynasore and shRNA were used to disturb the clathrin-mediated endocytosis. Based on the results of such experiments, we will analysis the impact of BATV infected cells by using NH4Cl and down-regulation of Rab5，Rab7 and Rab9. This research will provide new information for understanding the BATV infection. The research of BATV intrusion mechanism can provide the basis for the development of antiviral strategy and antiviral drugs.

近年，新发和再发人兽共患病频发，对人和家畜生命造成严重威胁。其中巴泰病毒能引起人非特异性发热,甚至发展为无菌性脑膜炎，家畜出现神经症状甚至引起流产。2012年我们在内蒙地区发热伴有神经症状牛的血清中分离到该病毒，系我国首次分离的牛源巴泰病毒。而目前国内外对巴泰病毒的研究较少，病毒的感染过程尤其是病毒入侵神经细胞的途径尚未明确。因此，我们初步开展BATV通过网格蛋白介导的内吞途径入侵神经细胞的研究。首先利用网格蛋白组装抑制剂、动力蛋白抑制剂及shRNA技术，对网格蛋白及动力蛋白表达进行抑制，干扰网格蛋白介导的内吞途径，分析其表达量下降对BATV入侵细胞效率的影响。再利用内体酸化抑制剂NH4Cl及shRNA技术，下调初级内体Rab5、次级内体Rab7和Rab9，进一步分析内体对BATV入侵细胞效率的影响。该项目对BATV入侵神经细胞机制的研究，为抗病毒策略的制定、抗病毒药物的研发提供依据。

巴泰病毒(Batai Virus，BATV)是一种虫媒病毒，可感染人和其他哺乳动物，严重的可引起脑膜炎甚至死亡，但其如何入侵易感细胞尚不明确。本项目首先开展BATV利用网格蛋白(CHC)介导的内吞途径入侵细胞研究。实验证明在BATV感染过程中添加CHC组装抑制剂CPZ和动力蛋白(dynamin)抑制剂dynasore后，以及利用siRNA下调CHC和dynamin-2表达量后，细胞内BATV含量显著下降。证明BATV可通过CHC介导的内吞途径入侵N2a细胞。并且利用NH4Cl调节BATV感染过程中细胞的酸性环境，结果证明BATV感染也需要酸性环境诱导。另外，我们开展了BATV入侵N2a细胞对内体依赖性研究。研究证明Rab5、Rab7和Rab9基因下调后细胞内BATV含量显著下降，说明初级内体和次级内体在BATV入侵细胞过程中起重要作用。此外，我们又开展了BATV进入N2a细胞后引起细胞凋亡研究。通过流式细胞仪检测发现BATV可诱导N2a细胞发生早期和晚期凋亡，并且凋亡程度随着病毒含量和感染时间的增加而加大。另外，Caspase-3活性检测结果表明BATV在感染细胞过程中可活化凋亡相关因子Caspase-3，进一步证明BATV可以诱导N2a细胞凋亡。. 本项目研究了网格蛋白介导的内吞途径与BATV细胞入侵的关系，明确了BATV入侵细胞的基本路径。探究了BATV入侵细胞对内体结构的依赖性，证实BATV入侵细胞需要酸性环境的诱导，并证明初级内体和次级内体在BATV入侵过程中的必要性。BATV可诱导N2a细胞发生凋亡，并且能够促进细胞凋亡蛋白Caspase-3表达水平上升，为深入探究BATV调控神经细胞凋亡的分子机制及抗病毒药物的研制奠定了基础，为全面了解BATV复制机制提供了数据支持。