肠道病毒71型感染所致混合性拮抗反应综合征与Toll样受体功能的关系研究

The TLRs mediate anti-virus immunization by recognizing the pathogen associated molecular patterns. Researches proved that the SCARB2 is not only the receptor of EV71, but also the endogenic ligand of the TLRs. Though researches knew the TLRs can recognize EV71, but it is unclear whether the TLRs mediate the mixed antagonist response syndrome(MARS) caused by EV71 infection. This project are performed in three parts including the tissue testing of the cardiac, lung, brain, liver and lymph nodes from the patients died of EV71 infection, transfection of EV71 VP1 gene to the human monocytes line THP1, isolating and culturing the primary monocytes from the blood of patients with EV71 infection and treating the cells with some agents. In this project we will utilize Imiquimod ( TLR7/TLR8 agonist) , capsid protein VP1 gene of EV71 and ST2825 (inhibitor of MyD88) as study tools. And use the biological technology such as transfection, in situ hybridization, flow cytometry, real-time PCR, western blot et al as reseach methods. The purpose of the project is to explore whether TLRs, its downstream proinflammatory/antiinflammatory cytokines and signal transduction molecule involving the anti-EV71 immune response, involving MARS caused by EV71 infection and its mechanisms. The project will Study whether the TLRs trigger the inflammatory reaction by binding with the endogenic ligands releaed by the injury tissues. and Explore the factors of interfering TLRs mediate the proinflammation and antiinflammation caused by the EV71 infection.

TLRs通过识别病毒的病原相关分子模式来介导抗病毒免疫，已知SCARB2既是EV71的受体也是TLRs的内源性配体、TLRs能够识别EV71，但TLRs是否介导EV71感染所致混合性拮抗综合征症尚不明了。本项目以EV71病毒衣壳蛋白VP1、TLR7/8激动剂咪喹莫特、MyD88抑制剂ST2825作为工具药，利用细胞转染、原位杂交、流式细胞术、实时荧光定量PCR、western blot 等分子生物学技术，通过对EV71死亡患者心、肺、脑、肝脏、淋巴结组织检测、体外单核细胞转染EV71病毒衣壳蛋白VP1基因、患者血原代单核细胞分离培养及干预，从三个层面研究TLRs及下游促炎/抗炎因子、信号传导分子是否启动EV71感染的抗病毒免疫；是否参与EV71感染所致混合性拮抗综合征及其作用机制；是否通过与组织损伤释放的内源性配体结合启动炎症反应；研究TLRs介导EV71感染所致促炎/抑炎反应的影响因素。

课题组以9例EV71 感染死亡病儿（EV71 组）和7 例非感染性疾病死亡病儿（对照组）为研究对象，观察肠道病毒71 型(EV71)感染死亡病例临床演变过程，探讨EV71神经损伤途径，反思EV71感染重症病例临床救治专家共识(简称专家共识)的临床分期。对肺、脑组织切片HE染色，观察了EV71死亡病人脑肺组织的病例改变。用免疫组化法、原位杂交法检测SCARB2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、HSP60、HMGB-1、MyD88在这些组织中的表达，探讨EV71与病毒受体SCARB2、与TLRs及相关炎症因子的相互影响关系，进一步研究EV71致病机理，为临床手足口病的诊治提供新的思路。通过原位杂交法检测Toll样受体7 mRNA（TLR7 mRNA）及免疫组化检测髓样细胞分化因子(MyD88)在EV71感染死亡病例中的表达情况，了解EV71感染与TLR7的关系，探讨EV71感染是否参与TLR7及其下游信号传导途径。研究了肠道病毒71 型( EV71) 感染并发神经源性肺水肿与神经细胞凋亡的关系。探讨了水通道蛋白 4(AQP4)及 P65 在肠道病毒 71 型(EV71)感染合并神经源性肺水肿(NPE)发病中的意义；研究了EV71病毒受体PSGL-1、Annexin A2在EV71感染死亡病例脑、肺组织中的表达及意义。对柯萨奇病毒 A6 型 VP1 蛋白的生物信息学分析，发现CVA6 VP1 为一亲水性蛋白，其相对分子量为 33. 6 kD，等电点为7. 92，含有24个可能的磷酸化位点，没有信号肽、跨膜区和可能的脂酰化位点;其二级结构中以无规则卷曲居多，有48. 52%的氨基酸残基暴露于溶液界面;该分子内存在多个潜在的线性B细胞表位，其中的155～165位氨基酸残基区域的抗原指数最高。预测到CVA6 VP1的基本理化性质、结构功能特征及可能的线性B细胞表位，为该蛋白的进一步研究及疫苗和免疫诊断试剂的研制打下基础。. 共发表论文12篇，其中中文核心期刊6篇。培养硕士研究生并5人，毕业论文均被中国优秀硕士论文数据库收录。参加全国儿科学术交流6人次，大会发言1次，电子壁报展示2次。在广西进行学术推广报告专题讲座3次，共约800余人参加。. 项目经费50万元，现已经支出20.65万元。剩余经费29.35万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。