大黄附子汤对实验性失血性休克复苏后小肠黏膜屏障功能保护作用的机理研究

临床观察显示，失血性休克复苏后常合并肠源性内毒素血症，进而导致复苏后多器官功能障碍综合征（MODS）。我们将大黄附子汤用于失血性休克复苏后，有效地遏制了MODS的发生、发展。初步研究发现其作用主要在于对小肠黏膜屏障功能的保护。为揭示其作用机理，我们以小型猪及SD大鼠失血性休克模型为研究对象，运用多谱勒技术与数字信号处理技术测定不同压力下肠道血流灌注变化；不同时段小肠与肺组织组织形态学变化并结合蛋白质组学技术筛选、鉴定差异蛋白质，应用免疫组化、Western blot等方法验证差异蛋白质表达；激光共聚焦扫描显微系统确定重要分子在肠黏膜细胞的位置，观察相邻细胞的胞间通讯方式并光学切片三维重建显示细胞器的空间关系及其变化，探讨①失血性休克不同压力下肠道血流灌注变化及其规律；②大黄附子汤对失血性休克复苏后小肠黏膜屏障功能保护作用的机理及其调控网络。为大黄附子汤的临床应用奠定理论基础。

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)是临床常见的急危重症，因机体的代偿反应， HS复苏后肠道仍然处于低氧和低灌注状态，导致肠道屏障功能破坏，导致内毒素血症。资料表明，HS的死亡率高达50%～90%。本项目研究的目的就是阐明大黄附子汤对HS复苏后肠粘膜屏障的保护作用，为临床应用提供理论依据。健康清洁级雄性SD大鼠，随机分为对照组、模型组、大黄附子汤组，再按模型制备后0、6、12h分为三个亚组。复制HS模型，大黄附子汤保留灌肠。激光散斑技术监测回肠末端血流量，动态比浊法检测血清中内毒素（LPS）的水平，ELISA法测定血清中肠脂肪酸蛋白（IFABP）、分泌型免疫球蛋白A（SIgA）水平。处死后分别取末端回肠，分离提取粘膜CD3+、γδT细胞，流式细胞仪检测CD3+、γδT细胞百分比；提取大鼠防御素-5（RD-5）mRNA，进行RT-PCR；光镜下观察小肠粘膜形态学变化。Western blot与免疫组化法Western blot与免疫组化法测定ZO-1、p-VASP蛋白表达。结果治疗组与模型组比较，随时间推移血流增加（119.28±6.50/99.99±0.81bpu， P<0.01），LPS、IFABP含量减低（21.23±3.33/27.09±3.55ng/ml；0.420±0.059/0.645±0.058 ng/ml， P<0.01），SIgA含量增高（P<0.01），肠道黏膜损伤程度减轻(1.78±0.24/3.64±0.25，P<0.01)，CD3+、γδT细胞含量百分比明显升高（P＜0.01）。RD-5的表达（P＜0.01），p-VASP蛋白表达下调（0.106±0.030/0.297±0.045 ng/ml， P<0.01），ZO-1表达上调（0.82±0.047/ 0.61±0.041ng/ml， P<0.01）。表明HS复苏后大鼠末端回肠血流量下降，肠道粘膜屏障被破坏。大黄附子汤增加HS复苏后小肠血流量，通过增加肠粘膜CD3+、γδT细胞含量百分比，诱导RD-5 mRNA的表达，上调ZO-1蛋白表达，下调p-VASP蛋白表达，从而减轻了肠道屏障的损害程度。此外，我们还尝试检测了大黄附子汤作用后大鼠胃肠道粘膜微生态变化，试图从肠道血运变化对微生态影响角度诠释其对肠屏障功能的保护作用。初步结果证明肠道血流的变化影响微生态的组成与丰度。