ROCK通路在取向纳米纱纤维环组织工程支架内BMSC细胞形变与定向分化中的作用与机制

The high postoperative recurrence of intervertebral disc herniation usually results from defects of annulus fibrosus (AF) and limited repairing potential. It is proposed that tissue-engineering technology can effectively repair the ruptured AF. However, the repairing effect depends on the material compatibility, inducing and regulation of interfacial cell growth differentiation, and the mastery of its mechanism. We have fabricated a novel aligned nanoyarn scaffold（AYS） which mimics the structure of AF extracellular matrix and has good mechanical strength. The bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are found to be deformed and grow into the scaffold in three-dimensional cell culture. Because ROCK signal pathway is associated with cytoskeletal protein, it can regulate cell deformation and participate in the regulation of TGF-β and CTGF on cell functions. This study aims to investigate the mechanism of morphologic changes of BMSC inside AYS through the intervention of ROCK pathway and observe the effect of ROCK pathway regulation in the directed differentiation of BMSC induced by TGF-β and CTGF. We implanted different AYS-BMSC composites into the model of defected pig AF and observed its interface fusion effect, so as to verify the function and mechanism of ROCK pathway in BMSC differentiation induced jointly by AYS and exogenous growth factors. The study will provide necessary theoretical and experimental basis for AF repair using tissue engineering technology.

椎间盘突出术后复发与纤维环破损及无法有效修复密切相关。组织工程技术可望有效修复，但对材料适配度以及材料界面细胞生长分化的诱导、调控及其机制的掌握将决定修复的成效。申请者前期制备的取向纳米纱支架(AYS)，具有类纤维环胞外基质结构和良好力学强度，在与骨髓间充质干细胞(BMSC)的三维培养中发现BMSC变形并长入支架内。因ROCK信号通路与细胞骨架蛋白相关，可调节细胞形变并参与TGF-β和CTGF对细胞功能的调控，本项目拟通过干预ROCK通路探索AYS内BMSC形变的机制；用TGF-β和CTGF诱导BMSC分化的同时通过调节ROCK通路，观察该通路在BMSC定向分化中的作用。在猪椎间盘纤维环缺损模型中，移植入不同调控状态下的AYS-BMSC复合体，观察界面融合效果，验证ROCK通路在AYS和生长因子共同诱导BMSC向纤维环细胞分化中的作用，为组织工程修复纤维环提供必要的理论依据和实验基础。

椎间盘突出术后出现复发与纤维环缺损无法有效修复相关。纤维环所受应力复杂，内部胶原纤维高度取向、交织排列，具有明显各向异性的力学特点。通过静电纺丝技术可以获得具有取向排列特点的纳米纤维支架。但这类支架纤维排列致密，细胞无法有效长入，此外，如何精准调控支架中干细胞向纤维环细胞分化也是一个悬而未决的问题。. 为了优化支架中细胞的长入效率，我们通过共轭纺丝技术构建了取向纳米纱支架，分析其力学特点以及与骨髓间充质干细胞的相互作用。对比分析不同培养方法对支架中干细胞长入效率的影响。为了模拟内外层纤维环不同的力学和结构特点，我们结合静电纺丝和冷冻干燥成形技术，制备了具有三维多孔结构的纳米纤维支架，通过将其与取向纳米纱支架结合，构建双层复合支架，检测骨髓间充质干细胞在不同支架中增殖、长入、分泌细胞外基质、向纤维环细胞定向分化等情况，并初步探究不同支架中ROCK信号通路参与调节骨髓间充质干细胞向纤维环细胞分化的可能机制。最后，我们通过构建比格犬颈椎纤维环缺损模型，评价了复合支架在体内修复纤维环缺损的效果。. 结果显示：取向纳米纱纤维支架具有高度取向排列的纤维结构和各向异性的力学特点，其在纤维排列方向上的最大抗拉强度略低于取向纳米纤维支架，骨髓间充质干细胞接种至该支架后长入效率较后者有所提高；运用生物反应器灌注培养可促进干细胞更好地长入支架内部；双层复合支架中多孔纳米纤维层具有纳米至微米级别不同孔径的孔隙结构，能够有效促进骨髓间充质干细胞长入；BMSC在不同支架中呈现出差异分化的特点，复合支架可诱导BMSC向内层纤维环细胞分化，而纳米纱支架可诱导BMSC向外层纤维环细胞分化，ROCK信号通路可能通过调控下游ERK信号通路参与这一过程；体内实验证实：骨髓间充质干细胞-支架复合体植入可有效修复比格犬纤维环缺损，减少椎间高度和椎间盘信号强度的丢失，提示其可作为潜在的组织工程支架用于纤维环缺损修复。