松材线虫携带细菌的鞭毛蛋白对黑松作用的机理研究

松萎蔫病是松树的一种毁灭性病害，该病的传播涉及松树、松褐天牛、松材线虫及其携带的细菌等多种生物，目前对松材线虫携带细菌产生的鞭毛蛋白等毒素在松萎蔫病病理进程中的作用还不十分清楚。本项目拟以松材线虫携带的荧光假单胞菌鞭毛蛋白为材料，分离黑松细胞膜上的鞭毛蛋白受体，鉴定鞭毛蛋白调控的基因及其调节的蛋白，系统分析鞭毛蛋白对黑松细胞的膜脂过氧化、活性氧产生、胞外pH及水解酶活性等多个生理生化指标的影响，以及鞭毛蛋白导致的黑松细胞死亡与松材线虫及其携带细菌繁殖之间的关系，揭示鞭毛蛋白对黑松细胞的致死机理，综合判断鞭毛蛋白在松萎蔫病病理进程中的作用，为萎蔫病的早期诊断、生物防治及抗性树种的培育打下理论基础。

松萎蔫病是由松材线虫引起的松属树种的一种毁灭性森林病害。近年来，越来越多的研究表明，松材线虫携带的致病细菌在松萎蔫病的病理进程中发挥着重要作用。课题组前期研究表明，松材线虫携带的一株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens GcM5-1A）能分泌导致黑松细胞死亡的鞭毛蛋白、环二肽等致病因子，且在感病黑松的枝条内检测到鞭毛蛋白的存在。本课题组在前期研究的基础上，开展了松材线虫携带的P. fluorescens GcM5-1A对黑松细胞的作用机制。结果表明，鞭毛蛋白处理黑松细胞导致活性氧(•O2–)的爆发，膜脂过氧化产物丙二醛和游离脯氨酸含量在处理初期快速上升，与氧化胁迫相关的三种酶超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性具有相似的变化趋势。在转录组水平上分析了鞭毛蛋白对黑松基因表达的影响，结果表明共1779个基因转录本在对照和处理样品中存在显著性差异，其中上调的有1257个，下调的有522个，注释了这些鞭毛蛋白调控基因的功能，并将其归于11个富集的代谢途径；蛋白质组学分析，也证实鞭毛蛋白调控了40种黑松蛋白差异表达，其中26种差异明显，这些蛋白多数参与了黑松细胞的防御及氧化胁迫等反应。转录组学和蛋白质组学研究都表明，鞭毛蛋白引起黑松细胞的一些病程相关蛋白上调表达，克隆了黑松细胞中受鞭毛蛋白上调表达的两个cDNA：银松素合成酶cDNA（Genbank 登录号：KF998274）及过氧化物酶cDNA（Genbank 登录号：KJ023090），在大肠杆菌中重组表达并纯化了这两种蛋白。研究了鞭毛蛋白对松材线虫繁殖的直接与间接作用，证实鞭毛蛋白本身作为营养成分能促进松材线虫的繁殖，且鞭毛蛋白还可通过诱导黑松愈伤组织细胞的死亡间接促进了线虫的繁殖，而松材线虫的表被蛋白对其携带细菌的繁殖有促进作用。此外，开题组还从黑松细胞膜上纯化了一种鞭毛蛋白结合蛋白，测定了其N-端序列；克隆了P. fluorescens GcM5-1A的一个过氧化物酶的基因（Genbank 登录号：KF751614），体内试验证实该基因可提高大肠杆菌对过氧化氢的抗性。最后，为开展与本课题相关的应用基础研究，课题组还发现小茴香提取物及大叶藻提取物具有同时杀灭松材线虫及其携带细菌的活性，并从大叶藻中分离鉴定了活性成分---迷迭香酸。该研究为深入了解松材线虫携带菌在松萎蔫病中的作用及松萎蔫病的