五酯片作为他克莫司节约药的物质基础及在CYP3A和P-gp通路的机制研究

他克莫司是器官移植患者需终生服用的一线免疫抑制剂，价格非常昂贵。合理联用他克莫司节约药降低其剂量，有重要意义。我们已证明了五酯片作为他克莫司节约药的有效性和安全性，率先证实了五酯片通过抑制CYP3A和P-gp介导的代谢和外排而提高他克莫司血药浓度的机制；并与美国哈佛医学院合作向NIH、FDA申请进行相关研究。但五酯片作为他克莫司节约药的物质基础及影响CYP3A和P-gp的直接证据尚不清楚。因此，本课题拟应用体内探针Cock-tail方法、RT-PCR、Western-blotting、荧光素酶报告基因检测、指纹图谱检测、LC-MS/MS等技术，阐明五酯片作为他克莫司节约药的化学和药代动力学物质基础，阐明五酯片对CYP3A和P-gp通路的短期作用特征和长期影响基因/蛋白水平的机制。最终为五酯片作为他克莫司节约药的临床应用提供更有力的科学证据，对实现他克莫司的合理用药有重要意义和应用价值。

他克莫司是器官移植患者需终生服用的一线免疫抑制剂，价格非常昂贵。合理联用他克莫司节约药降低其剂量，有重要意义。我们已证明了五酯片作为他克莫司节约药的有效性和安全性，但五酯片作为他克莫司节约药的物质基础及影响CYP3A和P-gp的直接证据尚不清楚。基于此，本研究开展了以下研究内容并取得了重要结果：1）建立了五酯片的指纹图谱、应用LC-MS/MS检测五酯片中的6种木脂素单体与含量，明确了五酯片作为他克莫司节约药的化学物质基础。2）筛选出五酯片中提高他克莫司血药浓度的最强作用成分——五味子醇乙；明确了五酯片中各木脂素单体在体内的血药浓度及在肝/肠的组织分布浓度；同时考察他克莫司对五酯片各活性成分药动学的影响，从而系统评价了五酯片作为他克莫司节约药的药代动力学物质基础。3）阐明了五酯片对CYP3A及P-gp通路的短期抑制特征与机制：使用P-gp经典探针底物，考察五酯片抑制P-gp活性的程度，获得了五酯片抑制P-gp活性的直接证据，明确五酯片提取物、五味子甲素、五味子醇乙以反竞争的机制抑制P-gp对Rhodamine 123的外排。使用CYP3A经典探针底物，获得了五酯片抑制肝、肠CYP3A活性的Ki、IC50等关键参数，明确五酯片抑制CYP3A为Mechanism-based Inhibition机制。4）阐明了五酯片对CYP3A及P-gp通路的长期影响与机制：双荧光素酶报告基因实验表明，五酯片提取物及其活性成分通过PXR通路对CYP3A4荧光素活性产生了中等强度及以上的诱导作用，对于CAR通路的影响相对较弱；长期灌胃给予五酯片对大鼠肝脏、肠道cyp3a9 mRNA表达有诱导作用，对大鼠肠道mdr1a mRNA表达亦有诱导作用，但对大鼠肠道、肝脏其他cyp3as (cyp3a1、cyp3a2及cyp3a18)、mdr1b mRNA表达无影响或者影响很小。长期灌胃给予五酯片可使大鼠肝脏CYP3A蛋白的表达略有上升，但对大鼠肠道CYP3A及肝脏P-gp影响微弱。综上所述，本研究阐明了五酯片作为他克莫司节约药的化学和药代动力学物质基础，阐明了五酯片对CYP3A和P-gp通路的短期作用特征和长期影响的机制，最终为五酯片作为他克莫司节约药的临床应用提供重要的理论指导和科学证据。