贝母辛通过调控Hedgehog通路核转录因子Gli1抑制肝星状细胞活化的研究

肝星状细胞的异常活化是肝纤维化进展的核心环节。表现为表达α-SMA，产生TGF、PDGF、ANGⅡ等，最终形成纤维瘢痕。本课题组前期工作表明，在HSC细胞株中Hedghehog通路中主要核转录因子Gli1通过上调a－SMA、PDGF、ANGⅡ等直接活化HSC。环耙明作为Hh通路抑制剂之一，通过能有效抑制HSC增殖，促其凋亡。前期工作表明贝母辛作为中药贝母的萃取物，同样有效抑制HSC中Gli1表达。故推测贝母辛是Gli1小分子抑制剂，我们拟首先采用RT-PCR等方法证实原代人肝脏HSC表达Gli1，并通过生物信息学、CHIP、RNAi、环耙明干预等方法验证Gli1下游作用基因。最后采用原代细胞培养及建立纤维化动物模型验证贝母辛对Gli1下游基因抑制及抗HSC活化作用。因此，本课题旨在论证贝母辛为Gli1小分子抑制剂；并为其有效抗肝纤维化作用提供实验依据。

肝星状细胞的异常活化是肝纤维化进展的核心环节。Hedgehog信号通路调控干细胞的分化、移行和增殖。然而长期以来其在肝纤维化过程中对肝星状细胞的调控作用未得到认识。.课题组体外培养肝星状细胞株HSC-T6及LX-2，发现Shh、Patched、Smo和Gli1均有不同程度表达。其次，我们用Blastn工具对人类基因的启动子进行比对分析，用XChIP-PCR方法证明在肝星状细胞LX-2中Gli1蛋白直接与Patched、IGFBP6、Bcl-2、α-SMA、Actin-β、PDGF和 ANG2基因的启动子结合。此外，我们构建了Gli1的RNA干扰载体，同时采用Hh信号通路特异性小分子抑制剂环耙明干预细胞，论证Gli1下游基因。.贝母辛，与环耙明结构相似，但目前相关研究少。本研究观察贝母辛对四氯化碳（CC14）致肝纤维化大鼠模型作用。发现贝母辛可显著降低大鼠血清ALT、AST、ALP及GGT(P<0.05)；降低血清HA、LN、PC-Ⅲ、1V-C的含量(P<0.01)；减少肝组织匀浆中Hyp、MDA含量(P<0.01)，增加SOD水平(P<0.01)。贝母辛能降低肝纤维化大鼠模型肝脏中TGF-β1、PDGF、α-SMA表达，二者5mg/kg剂量对Gli1基因表达差别无统计学意义。.细胞水平研究：通过MTT法发现贝母辛不同浓度下均明显抑制LX-2细胞的增殖。通过倒置相差显微镜观察及Tunel法发现高浓度的贝母辛、环耙明(100μmol/l)可以诱导LX-2细胞发生凋亡形态改变，用PI/AnnexinⅤ双染流式细胞检测证明用大剂量贝母辛、环耙明可诱导细胞早期凋亡，两组差别有统计学意义（P<0.05）。通过Realtime-RT-PCR方法发现LX-2经贝母辛、环耙明干预后，Hh通路主要组分Shh、Patched、Smo及主要核转录因子Gli1均显著降低（P<均0.01），且贝母辛抑制Shh-Gli1组分的作用优于环耙明（P均< 0.05）。同时二者均能降低Gli1下游靶基因表达（P<均0.01），且贝母辛对PDGF、IGFBP6 mRNA抑制作用优于环耙明（P均< 0.05）。.由此可见Shh-Gli1信号通路是参与肝星状细胞活化的重要通路之一。Hh小分子抑制剂贝母辛可有效抗肝纤维化，抑制肝星状细胞活化、促进其凋亡，有望成为有效的抗肝纤维化的药物。