Hedgehog信号通路调控S100A4基因促进肝星状细胞活化的分子机制研究

Hepatic fibrosis is the common pathological process of all kinds of chronic liver diseases developing to cirrhosis,the key is the activation of hepatic stellate cells.Previous work suggests that Hedgehog (Hh) signaling pathway and S100A4 are closely related to hepatic fibrosis;The transcription factor Gli1 of Hh signaling pathway regulates target genes,which is the molecular basis of Hh signaling pathway.Studies found that S100A4 gene might be the target gene of Hh signaling pathway.So,in this project cell culture and animal models of hepatic fibrosis are the experimental basis,We verify the Hh signaling pathway activate hepatic stellate cell by Gli1 regulating S100A4 target gene,using molecular biology and bioinformatics analysis methods.To solve the following questions:①To elucidate the correlation between members of the Hh signaling pathway and S100A4 gene expression in hepatic fibrosis;②To confirm Gli1 regulating S100A4 gene in hepatic stellate cell activation;③Combining the above results, to provide molecular biology evidence of hepatic stellate cell activation mechanism induced by Hh signaling pathway in the hepatic fibrosis.

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和途径，其中心环节是肝星状细胞的活化。前期工作表明 Hedgehog(Hh)信号通路、S100A4 与肝纤维化密切相关；Hh 信号通路末端转录因子Gli1对下游靶基因的调控是该信号通路的分子基础，有研究发现S100A4 基因可能是Hh信号通路的靶基因。因此，本项目以细胞培养及肝纤维化动物模型为实验基础，采用生物信息学分析结合分子生物学方法，对Hh信号通路中Gli1通过调控靶基因S100A4促进肝星状细胞活化进行验证。从而解决以下几个问题：①阐明 Hh 信号通路组分和 S100A4 基因在肝纤维化中表达的相关性；②明确肝星状细胞活化中Gli1 对S100A4 基因表达的调控作用；③结合上述结果，为探索肝纤维化中Hh 信号通路对肝星状细胞的活化机制提供分子生物学证据。

肝纤维化是慢性肝脏疾病共同的病理过程，也是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，其细胞病理学基础为肝星状细胞活化。Hedgehog信号通路是生物体内重要的信号传导通路，我们推测其机理可能为核转录因子Glis进入细胞核与其下游基因启动子区增强子序列结合，调控下游靶基因的转录表达，使肝星状细胞活化。我们在本课题中研究了Hh信号通路成员分子在肝星状细胞株及肝纤维化组织中的表达，以及Hh信号通路特异性小分子抑制剂在体外对细胞增殖和凋亡的作用。并且对Gli1下游靶基因做了初步的研究。. 首先，研究了Hh信号通路成员在肝星状细胞株和肝纤维化组织中的表达。结果显示在两株活化的肝星状细胞株、正常大鼠肝脏组织、纤维化大鼠肝脏组织中Shh、Patched、Smo和Gli1均有不同程度表达。此外，纤维化大鼠肝脏中Shh、Smo、Gli1及肝星状细胞活化基因α-SMA mRNA均明显高于正常大鼠；免疫组化及Western-blot方法也证实肝纤维化大鼠Shh、α-SMA蛋白表达均明显高于正常组大鼠。. 其次，我们用Blastn工具对人类基因的启动子进行比对分析，得出理论上的的Gli1调控基因谱。建立染色质免疫沉淀技术（ChIP），并以此方法验证在肝星状细胞LX-2中筛选出的部分基因的启动子与转录因子Gli-1蛋白结合。结果我们通过生物信息学分析，得出了在启动子区含有与Gli-1结合元件高度同源序列的基因。然后，用免疫沉淀加银染色法和免疫沉淀加免疫印迹法证明Gli1在LX-2细胞呈阳性表达。最后，用XChIP-PCR方法证明在肝星状细胞LX-2中Gli1蛋白直接与Patched、IGFBP6、Bcl-2、α-SMA、Actin-β、PDGF2和 ANG-2基因的启动子结合。.  综上所述，Hedgehog(Hh)信号通路与肝纤维化密切相关，Hh信号通路末端转录因子Gli1对下游靶基因的调控是该信号通路的分子基础。