中性粒细胞外捕网在胃癌进展、高凝状态中的作用

Metastasis and venous thrombosis are two main causes of death in patients with gastric cancer. Neutrophil extracellular traps (NETs), a novel cell death pathway, are composite aggregates of DNA strands, histones, and granular proteins, and play a vital role in the etiopathogenesis of inflammation, hemostasis and thrombotic phenomenon. However, the role of NETs in gastric cancer progression is relatively unclear. We firstly found that NETs significantly increased, and correlated with tumor progression, and contributed to hypercoagulable state in patients with gastric cancer. Therefore, we speculate that NETs formation contributes to gastric cancer cell growth, invasion, metastasis, and hypercoagulable state formation, and then leads to poor prognosis in gastric cancer. In this research, we will further investigate the role of NETs formation in cancer cell growth, invasion, metastasis,and venous thrombosis through in vivo an in vitro study, using immunofluorescence microscopy，electronic microscopy and so on, in gastric cancer patients and mice. These will help to provide a new and effective biomarker indicating the prognosis and to design reasonable treatment in patients with gastric cancer.

胃癌是常见高度恶性肿瘤之一，主要致死原因为远处转移及血栓形成。中性粒细胞胞外捕网（NETs）是一种新的中性粒细胞死亡方式，其由细胞外DNA构成骨架，周围附着中性粒细胞相关蛋白，在炎症、自身免疫、血栓形成等相关疾病形成及进展过程中起重要作用，但在胃癌进展中的作用目前未见相关报道。申请人首次证明，胃癌患者外周血中NETs形成明显增加，与肿瘤进展显著相关，并促进高凝状态形成。我们推测中性粒细胞可能通过NETs形成促进胃癌进展，导致不良预后。本研究将通过体内、体外实验，利用电镜、免疫荧光等方法分析临床胃癌标本、患者外周血中NETs形成的量，进一步探索NETs在促进胃癌生长、侵袭、转移及血栓形成中的作用及相关机制。该研究从新的视角揭示中性粒细胞促进胃癌进展的作用及机制，为提高胃癌的诊治水平提供新的靶点及治疗策略。

本课题在首次报道NETs在胃癌患者血液中高表达的基础上，对NETs在胃癌组织及不同分期胃癌患者进行了相关研究，并检测了NETs对胃癌进展的影响。在临床样本检测中，我们对正常人和不同TNM分期胃癌患者血浆NETs水平进行了检测。cf-DNA、NE、MPO-DNA复合物被用来作为NETs定量的指标，Quant-iTPicoGreendsDNA检测试剂盒被用来检测样本的cf-DNA水平，NE和MPO-DNA复合物的检测则通过ELISA实现。用健康受试者和肿瘤患者的的血浆去刺激中性粒细胞来观察GC患者肿瘤微环境对NETs产生的影响，用免疫荧光实验对中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophilelastase,NE）和胞外DNA共定位作为NETs产生的标志。随后，通过对人胃癌组织和切缘正常胃组织进行对比分析，通过组织荧光和western-blot双重实验来验证NETs在肿瘤和正常组织中表达是否存在差异。离体实验中，我们首先对DNAse-1和GSK-484对NETs抑制情况进行了验证。用含有NETs、或经DNAse-1/GSK-484处理后的NETs培养液去刺激胃癌细胞。通过Transwell实验、MTT实验、细胞流式周期检测实验观察了NETs对胃癌细胞迁移、细胞活力、细胞周期的影响。随后，通过western-blot实验检测上皮marker和间质marker的变化来观察NETs对胃癌细胞EMT进程的影响。在体实验中，通过人AGS胃癌细胞系裸鼠皮下移植瘤残留模型实验观察DNAse-1/GSK-484抑制NETs后对肿瘤生长情况（肿瘤体积、瘤重）和小鼠一般状态的影响，验证NETs抑制剂的抗肿瘤中作用，并检测DNAse-1/GSK-484的使用安全性，随后通过免疫荧光和western-blot观察两种抑制剂对实体肿瘤NETs沉积的影响，随后通过免疫组化westernblot观察两组抑制剂对AGS实体肿瘤中EMT的影响。最后，在CLP后行脾静脉注射AGS细胞建立裸鼠肝转移瘤模型，通过组织荧光和western-blot对NETs抑制情况进行检测，并检测DNAse-1/GSK-484抑制NETs后对胃癌肝转移的影响。同时我们对NETs对胃癌细胞凋亡的影响进行了观察，发现NETs在一定程度上能够促进胃癌细胞凋亡。NETs在肿瘤进展中可能发挥着双刃剑的作用，其在肿瘤进展中的作用有待进一步研究。