牦牛乳硬质干酪成熟期生物胺的形成机理与调控

Hard cheese made from yak’s milk containing high levels of free amino acids and with long ripening is apt to produce biogenic amines and therefore the project intends to regulate exactly and effectively biogenic amines and enhance cheese quality and safety. Starting with the microorganism of the cheese, the project will analyze the bacterial flora during the ripening, determine growth features of amine-producing microorganisms, evaluate the amine-producing abilities, screen the dominant amine-productive bacteria, and ascertain microbial formation mechanism of biogenic amines in hard cheese made from yak’s milk by the PCR-DGGE, PCR, RP-HPLC and microbiologic methods; Biogenic amines are investigated by the method of RP-HPLC, and evolution characteristic of biogenic amines is analyzed on the base of monoamines, diamines, polyamines, total biogenic amines and biogenic amine index; Formation mechanism of biogenic amines is verified on the base of physicochemical indexes, mcrobial structure, growth features of amine-producing microorganisms, decarboxylase activity and characteristic of biogenic amines. Furthermore, the study will analyze the influence of technological factors such as starter, raw milk treatment, ripening condition and salt on the biogenic amines in order to clarify cumulative mechanism of biogenic amines and explore the control methods during the maturation of hard cheese made from yak’s milk. Therefore, the investigation will provide the theoretical and practical evidences for improving quality and safety of hard cheese made from yak’s milk.

牦牛乳硬质干酪因含高游离氨基酸、成熟期长等特点，面临着如何精准、有效调控生物胺积累，确保干酪质量安全这一科学问题。本项目以牦牛乳硬质干酪为研究载体，从干酪微生物入手，综合运用PCR-DGGE、PCR、RP-HPLC和微生物学方法，分析干酪成熟过程中微生物种群分布，测定产胺微生物生长特性，评价产胺能力，鉴定主要产胺微生物，探明干酪生物胺形成的微生物机制；利用RP-HPLC，动态跟踪干酪成熟过程中生物胺变化，从单胺、二胺、多胺、总生物胺量、生物胺指数等全面表征干酪生物胺演变特征；基于干酪理化指标、微生物种群分布、产胺微生物生长特性、氨基酸脱羧酶活性、生物胺等演变趋势，多维度、全面解析干酪生物胺形成机理。结合干酪生产工艺，从发酵剂、盐种类和含量、成熟条件、原料乳处理方式为切入点，揭示干酪生物胺调控机制，探究调控干酪生物胺累积的重要加工因子，为提高牦牛乳硬质干酪品质和质量安全提供理论和实践依据。

成熟干酪易产生生物胺，不同品种干酪中生物胺存在巨大差异。近年来，随着食品安全问题的突出，干酪生物胺研究已成为乳品科学关注的热点问题。牦牛乳硬质干酪富含蛋白，成熟期长，风味浓郁，营养价值高。然而，牦牛乳硬质干酪生物胺形成机理的研究尚未系统开展，极其缺乏对牦牛乳产业的理论指导。为此，本项目运用高效液相色谱法、高通量测序技术对牦牛乳硬质干酪中生物胺和菌落结构进行了测定和分析，并进一步对不同发酵剂、盐含量和原料乳处理方式制作的牦牛乳硬质干酪中理化性质、蛋白质降解、微生物生长特性、酶活性、生物胺等进行了测定。其主要研究结果如下：.1.牦牛乳硬质干酪中主要生物胺为腐胺、2-苯乙胺、酪胺、组胺和尸胺。干酪中游离氨基酸含量与除组胺之外的各生物胺、总生物胺含量、成熟时间之间具有显著正相关性（P＜0.01，P＜0.05），各生物胺含量之间也存在正相关性。不同成熟期干酪包含相同属的微生物，其中链球菌属（Streptococcus）为优势菌属，平均相对丰度为84.63%，明串珠菌属（Leuconostoc）次之，平均相对丰度为6.91%，不同成熟期干酪中各菌属相对丰度具有差异。.2.嗜热发酵剂干酪中游离氨基酸含量最高，嗜温发酵剂次之，混合发酵剂干酪中游离氨基酸含量最低。盐添加量的降低导致干酪pH值、NaCl、脂肪、蛋白质、游离氨基酸含量等降低，干酪水分活度增加，在成熟后期，其微生物自溶程度降低。随着牦牛乳冷藏时间延长，其干酪中水分含量和蛋白质降解增加，NaCl和脂肪含量降低。冷藏72h组干酪中乳酸脱氢酶和PepX活性较高，其细菌、乳酸菌等也呈增加态势。与未经过热处理组比较，63℃和72℃处理组干酪水分、蛋白质含量显著增高（P<0.05），而其脂肪、NaCl含量、菌落总数显著降低（P<0.05）。.3.随着成熟时间的延长，牦牛乳硬质干酪中生物胺含量增多，但是所有干酪中生物胺含量均未超过专家建议含量。从降低生物胺的角度来讲，嗜热及嗜温发酵剂的混合使用、降低NaCl含量、缩短原料乳冷藏时间及采用热处理方式，均可降低牦牛乳硬质干酪中生物胺含量。采用显色培养基筛选出一株产胺微生物，经分子生物学鉴定为Enterococcus durans。该菌株能够产生产2-苯乙胺、腐胺、尸胺和酪胺等多种生物胺。该项目探明了牦牛乳硬质干酪生物胺的调控机制，为确保干酪质量安全性提供了理论和实践依据。