基于稳定同位素化学标记的定量蛋白质组学新方法研究及其在喉癌生物标志物筛选中的应用

The chemical labeling measuring techniques based on stable isotope followed by mass spectrometric analysis have been widely used in quantitative proteomics studies. The method based on MS/MS for the proteomics studies has high sensitivity and exhibits more excellent properties than MS method that will increase the complexity of data analysis, but MS/MS method still has some shortcomings, such as the signal suppression of low weight reporter ion or sequence information ion, and affects the accuracy and coverage for the data analysis. In view of these problems, we synthesized a series of isotope labeled isothiocyanate ester reagents. The labeled peptides by these reagents easily give the Edman-Type cleavage, and produce high abundance reporter-ions, without loss of the information of sequence fragments. At the same time, these reagents have better MS compatibility and sensitivity. In this project, we will develop two methods based on these reagents, namely Isobaric Peptide Termini Labeling (IPTL) strategy and Isobaric Tag (IT) strategy. Two new methods can improve the precision, accuracy and coverage in protein sample analysis. The established methods will be employed to analyze the proteome of laryngeal cancer cells and normal laryngeal cells, and screen out a lot of potential biomarkers. The biological function of potential biomarkers will be evaluated by bioinformatics tools. These researches should provide detailed data for the early diagnosis of laryngeal cancer and provide important information for the mechanism study of the laryngeal cancer occurrence and development.

稳定同位素化学标记技术已被大量应用于生物体系的定量蛋白质组学研究。基于二级质谱的定量蛋白质组学方法不会增加一级质谱复杂度，且具有较高的灵敏度，但该类方法仍存在不足，如低端报告离子或序列信息离子信号抑制，影响了定量的准确度和覆盖率。针对目前存在的问题，本项目合成了同位素标记的异硫氰酸酯类标记试剂，该类试剂标记的多肽能够发生Edman 降级式碰撞裂解，产生较高丰度报告离子，同时不丢失测序碎片信息，且具有更好的质谱兼容性和灵敏度。基于此类试剂建立了新型等重肽末端标记策略 (IPTL) 和新型等重标签 策略(IT)，用于提高相对定量的精确度、准确度和覆盖率。利用所建立的方法对喉癌细胞与正常喉细胞蛋白质组进行分析，从喉癌细胞中筛选出潜在的生物标志物，并对差异蛋白进行生物信息学分析，以期为喉癌早期诊断标志物的研究提供参考，为进一步从分子水平阐明喉癌的发生发展机理提供详实数据。

本项目制备、表征了10种用于蛋白质和小分子肽标记的稳定同位素（H/D）编码的异硫氰酸酯类分子探针，所标记的多肽蛋白能够发生Edman 降级式碰撞裂解，其质谱断裂既给出较高丰度的报告离子的相关信息。基于新的H/D轻重原子编码的异硫氰酸酯类标记试剂，建立了血管紧张素（3种）、脑啡肽（2种）、胆囊收缩素（3种）、精氨酸加压素等肽段的质谱定量方法，并将其运用于人体血浆中多肽含量的测定。对脑啡肽的质谱裂解规律解析发现，脑啡肽肽段中的Gly（甘氨酸）位点处裂解后生成的都是bi离子，发现多肽的质谱裂解若两个临近的碎片质核比差值为57时，则此处碎片有很大可能为Gly-Gly序列形成的bi型碎片离子。这一新发现有助于在多肽质谱测序中对Gly-Gly序列的特异性识别，提高多肽的质谱测序效率。实验中还将稳定同位素标记应用于人体血浆样品的检测，筛选出正常人与喉癌病人血浆中含量具有显著性差异的小肽。此外，由于半胱氨酸所形成的二硫键对肽和蛋白质结构起着重要的作用，以此为突破点，拓展制备了８种含马来酰亚胺基团的稳定同位素分子探针，用于特异性含巯基（-SH）蛋白或肽段的标记，我们设计了两类针对半胱氨酸中独有的巯基（-SH）的轻重编码标记试剂，分析总结了含巯基肽段的特殊质谱裂解规律，拓展了含巯基（-SH）蛋白和肽的快速分子标记和质谱方法的鉴定。此外，制备了４种含有羧基官能团的分子探针，用于生物胺、脂肪胺的标记；制备了９种含氨基官能团的小分子探针，用于脂肪酸、三帖酸、胆汁酸的标记；制备了２种含卤素碘的稳定同位素标记试剂，用于硫醇、硫酚的标记；制备了２种含吡唑烷酮基团的分子探针，用于小分子糖类的标记，这些探针开发为生物分子的轻重同位素编码的标记、质谱分析和新方法建立等奠定了基础。