丹酚酸B生物合成关键催化酶丹参漆酶的发现与功能研究

Salvianolic acid B is one of the main active compounds in Dan-Shen (Salvia miltiorrhiza), which is commonly used in the treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases. Understanding the biosynthetic pathways of the active compounds in S. miltiorrhiza is the basis for its quality control and breed improvement. We have worked on the biosynthetic pathway of salvianolic acid B for long time and found out that laccases may be the important enzymes catalyzing rosmarinic acid to form salvianolic acid B. During the past work, 38 laccases had been found out from the genome of S. miltiorrhiza. However, the functions of laccases vary as they belong to multigene families in plants. How to determine their catalytic function in S. miltiorrhiza has become an urgent problem in the study of laccases. We have found 6 laccases that might take part in the biosyntheses of salvianolic acid B in previous work. This study will clone the 6 laccase genes at first, and then obtain the laccase proteins by heterogeneous expression. After that, the in vitro functional verification of laccases will be carried out to detect whether they can catalyze rosmarinic acid to produce salvianolic acid B. The content of salvianolic acid B in laccase-knockout and overexpressed mutants will be studied to clarify their function in vivo. Finally, the protein structure of laccases will be studied to confirm their catalytic mechanisms. The catalytic efficiency of laccases will be optimized by protein structure modification. This study will complement the last but not the least step in salvianolic acid B biosynthesis. In addition, it will set the foundation for the implement of plant metabolic engineering and synthetic biology technologies for the protection and quality improvement of Dan-Shen.

丹酚酸B（SAB）等酚酸类物质是丹参治疗心脑血管疾病的药效成分，开展SAB生物合成途径解析是进行丹参品质调控和品种改良的基础。本课题组长期致力于阐明SAB生物合成途径，发现漆酶可能催化迷迭香酸生成SAB，并从丹参基因组中找到了38条漆酶。但漆酶家族成员功能各异，如何确定其催化功能，已成为丹参漆酶研究的迫切问题。课题组前期从丹参漆酶中筛选得到6条可能参与SAB生物合成的漆酶，为了明确这些漆酶的功能和作用机制，本项目拟克隆获得这些漆酶，通过异源表达得到漆酶蛋白，进行体外功能验证，检测其是否能够催化迷迭香酸生成SAB；分析漆酶敲除和过表达突变体中SAB的变化情况，明确其体内功能；最后解析漆酶蛋白结构，阐明其催化机制，通过蛋白结构修饰，优化其催化效率。本项目将完成SAB生物合成途径最后一步的绘制，为开展以调控丹参漆酶为遗传操作靶标的精准代谢工程，提升丹参品质，保护丹参资源提供科学支撑。

丹酚酸B是丹参酚酸类药效物质的代表，是丹参治疗心脑血管疾病的主要药效成分之一。丹酚酸B具有重要的药用价值和经济效益，促进丹参中丹酚酸B的积累具有现实意义。利用生物技术手段阐明丹酚酸B的生物合成途径，通过代谢工程或合成生物学方法提高丹酚酸B含量，更有效、可持续和低成本的获得植物药源，已成为丹参资源及活性产物研究的重要内容和新的发展方向。本项目组长期从事丹酚酸类化合物生物合成途径的研究，前期利用同位素示踪结合代谢流分析技术，首次完整地阐述了丹酚酸B的生物合成过程，发现丹参中酚酸类化合物共用同一生源途径，迷迭香酸是丹酚酸B的直接前体。根据丹酚酸B化学结构和丹参表达谱数据分析，推测丹参漆酶（Laccase）可能参与了迷迭香酸向丹酚酸B的转化过程，是丹酚酸B生物合成途径中最终步骤的关键酶，对丹酚酸类化合物的生物合成具有重要调控作用。本项目基于丹参基因组数据，通过生物信息学方法从中找到了69个丹参漆酶，其中29条为具有完整编码结构的序列。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对丹参漆酶基因家族进行多基因敲除，发现丹参漆酶不仅影响丹酚酸B的生成，对木质素的积累也有直接作用，在丹参的生长、发育以及酚酸代谢过程中发挥重要作用。通过分析丹参漆酶在丹参不同组织部位中的表达模式，结合丹酚酸B的分布位置，筛选出五条可能与丹酚酸B生物合成密切相关的丹参漆酶基因。通过计算丹参漆酶与不同结构底物的亲和力，以及对不同底物酶活效力的测定，进一步筛选出3个重点基因SmLAC7、SmLAC20和SmLAC28。通过RNAi抑制实验和漆酶基因过表达研究，发现这三个漆酶基因直接影响丹酚酸B的产量，并且对丹参毛状根的组织结构有一定影响。本项目的实施，证明了丹参漆酶在丹酚酸B生物合成过程中的作用，为利用植物次生代谢工程手段调控丹酚酸B及其他酚酸类药效物质的生物合成奠定了理论基础并提供了技术保障。