基于叶绿体转基因技术提高曼陀罗东莨菪碱含量的研究

Chloroplast transformation based on information of chloroplast genomes. It applies a series of molecular biology techniques to express exogenous genes in the chloroplasts. Chloroplast transformation is becoming a potential technology in the transgenic field because of its advantages. It avoids many problems caused by nuclear transformation, such as low efficiency of gene expression and genetic instability. Hyoscyamine 6β-hydroxylase (H6H) is an enzyme which catalyzes hyoscyamine to form 6β-hydroxy hyoscyamine and then scopolamine is formed through epoxidation. The expression level of hyoscyamine 6β-hydroxylase determines the formation of scopolamine directly. This study focuses on the hyoscyamine 6β-hydroxylase and wants to improve the products of scopolamine in Datura Stramonium leaves by overexpressing h6h in D. Stramonium chloroplast through transgenic technology. The aim of this study is to provide an important new source for scopolamine. This may have an great effect on the protection of medicinal plant resources. This study introduces chloroplast transformation techniques to medicinal plants for the first time and we hope to build a platform of chloroplast transformation for medicinal plants and to find a new way for medicinal plants protection.

叶绿体转基因技术是基于叶绿体基因组信息，通过一系列分子生物学技术，在叶绿体上表达外源基因的一种方法。由于其避免了核转基因所引起的诸如基因表达效率低、遗传不稳定等问题，叶绿体转基因正在成为转基因技术中颇有前途的领域。莨菪碱-6β-羟化酶（H6H）是催化莨菪碱羟基化形成6β-羟基莨菪碱，进而环氧化6β-羟基莨菪碱形成东莨菪碱的酶，其表达直接影响着东莨菪碱的生成。本研究以莨菪碱-6β-羟化酶基因为研究对象，欲通过叶绿体转基因手段，将其转入曼陀罗的叶绿体，希望通过叶绿体转基因技术，提高曼陀罗叶片中东莨菪碱含量，使非药用部位- - 曼陀罗叶片成为新的东莨菪碱的重要来源，以保护日渐稀少的药用植物资源，建立一种基于中药有效成分的有机生物合成转化模式。本研究首次将叶绿体转基因技术引入药用植物当中，希望建立一个药用植物叶绿体转基因技术平台，为药用植物资源保护开辟一条新的途径。

药用植物的特殊性在于其具有治病救人的药效物质，而城市化的扩张和污染，加剧了药用植物资源紧缺的困局。通过生物技术手段，使原本不含有药用成分的植物生成药用成分，或者使原来不含有药用成分的部位生成药用成分，从而扩大药用植物有效利用范围，保护药用植物资源，是亟待解决的问题。叶绿体结构的特殊性，使其成为潜在的绿色工厂，正受到广泛关注。通过叶绿体基因工程，将药效物质合成途径中的关键酶基因在叶绿体上高效表达，有望实现特定药效物质在叶片中的积累，从而使药用植物实现可持续利用，达到资源保护的目的。莨菪碱和东莨菪碱是曼陀罗属药用植物的特殊药效成分，目前对东莨菪碱的需求远大于莨菪碱。本项目以曼陀罗和毛曼陀罗为例，将可催化莨菪碱羟基化形成6β-羟基莨菪碱，进而环氧化形成东莨菪碱的莨菪碱-6β-羟化酶基因（h6h）通过叶绿体基因工程转入到曼陀罗和毛曼陀罗的叶绿体中，希望实现这两种药用植物叶片中莨菪碱向东莨菪碱的转化，进而实现东莨菪碱的富集。首先建立了曼陀罗和毛曼陀罗的栽培体系，对曼陀罗叶绿体基因组进行了测序，用来精确寻找适合外源基因插入的位点，得到一条长155,871 bp，含有132个基因的环形叶绿体基因组序列。其次将克隆得到的h6h基因和其他表达元件一同构建叶绿体表达载体，并在体外验证了该载体的结构和功能。然后通过基因枪轰击，将叶绿体表达载体转化到曼陀罗和毛曼陀罗的叶绿体中，经过壮观霉素抗性筛选，培养得到再生植株。检测再生植株中生物碱含量，发现转化了h6h基因的植株中，东莨菪碱与莨菪碱的比率明显高于对照组，证实叶绿体转化h6h基因确实能提高东莨菪碱在叶片中的积累。本项目通过转化h6h基因，实现了曼陀罗属药用植物叶片中东莨菪碱的富集，使非药用的曼陀罗属植物叶片有望成为提取东莨菪碱的原料，从而实现保护曼陀罗属药用资源的目的，为其他药用植物的资源保护提供了一种新的思路，为建立一种基于中药有效成分的有机生物合成转化模式提供了参考。