马链球菌兽疫亚种Fic结构域蛋白通过影响宿主Rho GTP酶活性损伤猪呼吸道上皮屏障的机制

Streptococcus equi ssp. zooepidemicus (SEZ) can cause Swine streptococcosis. It may infect host through respiratory tract. In previous research, we found Fic domain protein FicSEZ in SEZ and identified its interaction with host protein Ezrin. This interaction has influence to activation of Rho GTPase, but its molecular mechanism and relationship with porcine respiratory epithelium barrier integrity are both still unknown. In this research, we plan to employ the antibody microarray, LC-MS/MS, point mutation and homologous modeling technologies to illustrate the mechanism of effecting activation of Rho GTPase through FicSEZ and Ezrin interaction; identify the structure of FicSEZ protein and analyze the relationship between its function and Fic domain; find out how FicSEZ influences the cytokine secretory, tight junction proteins and cytoskeleton signal pathway through regulate activation of Rho GTPase; evaluate the relationship between these signal pathways and respiratory epithelium barrier integrity with porcine primary respiratory epithelial cells and in-vitro respiratory epithelium barrier model. Illuminate the molecular mechanism of FicSEZ disrupts porcine respiratory epithelium barrier through effecting Rho GTPase activation.

马链球菌兽疫亚种（SEZ）是猪链球菌病的重要病原之一，可经呼吸道感染宿主。前期研究发现在SEZ中存在具有Fic结构域的毒力因子FicSEZ蛋白，证实该蛋白可与宿主上皮细胞中Ezrin分子互作，影响胞内Rho GTP酶活性，但其分子机制以及与猪呼吸道上皮屏障完整性的关系均有待进一步研究阐明。本研究拟利用抗体芯片、质谱分析、点突变与同源建模等技术，阐明FicSEZ与宿主Ezrin互作影响Rho GTP酶活性的机制；解析FicSEZ蛋白结构并分析Fic结构域与其功能的联系；探究FicSEZ影响Rho GTP酶活性对呼吸道上皮细胞中细胞因子分泌，紧密连接蛋白和细胞骨架稳态相关信号通路的作用。在此基础上用猪原代呼吸道上皮细胞及体外呼吸道上皮屏障模型评价上述信号通路相关表型与呼吸道上皮屏障完整性的关系，最终阐明FicSEZ通过影响宿主Rho GTP酶活性损伤猪呼吸道上皮屏障的分子机制。

马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp. zooepidemicus，SEZ）可经呼吸道途径感染宿主，但其穿透呼吸道屏障的具体机制尚未有深入研究。在前期工作中，我们发现SEZ的Fic结构域蛋白BifA（原名FicSEZ）可影响Rho GTPase活性，继而影响宿主细胞的多种生物学功能，很可能参与细菌对宿主呼吸道屏障的破坏过程。本研究检测了不同攻毒途径下SEZ对小鼠各脏器，尤其是肺部的感染特点；完成了体外呼吸道屏障模型的建立和BifA蛋白的表达纯化；发现BifA进入中性粒细胞后可以与Ezrin互作并引起该蛋白磷酸化水平维持高位，继而募集环境中Dbl分子，使得小G蛋白异常活化，影响中性粒细胞对SEZ的杀灭。大量中性粒细胞浸润可损伤呼吸道屏障，导致细菌有机会穿透屏障并造成呼吸系统和全身性感染。为了进一步拓展研究思路，我们完成了呼吸道上皮A549细胞的CRISPR突变体文库和SEZ转座子突变体文库构建，并对转座子突变体文库中与SEZ血液感染和肺部感染相关的基因进行了筛选，初步锁定了可能影响细菌适应肺部环境、突破呼吸道屏障和进入血液后在其中存活相关的基因，为细菌破坏呼吸道屏障相关机制的进一步发掘奠定了基础。