PILRα通过下调β2整合素活化抑制肾脏纤维化的调节作用和分子机制研究

Macrophage inflammatory response plays a key role in the development of renal fibrosis. It is important to inhibit macrophages recruitment to improve renal fibrosis in current research. Our preliminary expriment showed that the knockout of immunoglobulin-like type 2 receptor alpha (PILRα) gene can significantly aggravate renal fibrosis and macrophage infiltration in mice. However, the mechanism of regulation of PILRα is unknown. It has been reported that PILRα can reduce the inflammatory response by inhibiting the activation of β2 integrin which mediates inflammatory cells adhesion and migration across the blood vessel wall. It is speculated that PILRα may reduce the progression of renal fibrosis by inhibiting the activity of β2 integrin. In this study, we established renal fibrosis model in PILRα knock out mice, and used plasmid transfection, confocal microscopy, blocking antibody and other methods to explore the role of PILRα in inhibiting the adhesion and migration of macrophages and the secretion of profibrotic molecules by inhibiting exposure of the activation epitope and conformational activation of β2 integrin. Using bone marrow transplantation and blocking antibody experiment, we will elucidate the effect of PILRα on the inhibition of renal fibrosis by negatively regulation of the axis of β2 integrin and macrophage. This study may provide a new theoretical basis and therapeutic targets for the treatment of renal fibrosis.

巨噬细胞炎症反应在肾脏纤维化的发生发展中起关键作用，抑制巨噬细胞募集是改善肾脏纤维化的关键环节。申请人前期研究发现，成对免疫球蛋白样2型受体α（PILRα）基因敲除可显著加重小鼠肾脏纤维化和巨噬细胞募集，但PILRα的作用机制不明。据报道，PILRα可以通过抑制炎症细胞募集的关键分子-β2整合素的活化，减轻炎症反应。由此推测：PILRα可能通过抑制β2整合素活性降低巨噬细胞在肾脏的募集与浸润，从而减轻肾脏纤维化的进展。本项目利用PILRα基因敲除小鼠建立肾脏纤维化模型，采用质粒转染、共聚焦显微镜和封闭抗体等方法，探讨PILRα通过抑制β2整合素活化片段暴露及构象活化来降低巨噬细胞的粘附、跨内皮迁移及促纤维化因子分泌的作用。并利用骨髓移植和封闭抗体实验，阐明PILRα通过抑制β2整合素-巨噬细胞轴抑制肾脏纤维化的机制。本项目的研究成果有望为肾脏纤维化的治疗提供新的靶点和科学理论依据。

急慢性肾脏疾病导致肾功能衰竭的共同途径为肾纤维化。研究发现巨噬细胞的炎症反应在肾脏纤维化的发生发展中起关键作用，抑制巨噬细胞募集是改善肾脏纤维化的关键环节。成对免疫球蛋白样2型受体α（PILRα）是参与炎症反应的重要表面分子，我们的研究中利用腺嘌呤喂食小鼠建立肾脏纤维化模型，在动物实验中，我们测定Scr和BUN评估肾功能受损情况，发现 PILRα 基因敲除可明显加重肾脏损伤程度。通过PCR和染色发现PILRα 基因敲除可显著加重肾脏纤维化。免疫染色发现 PILRα基因敲除可促进巨噬细胞在肾脏的聚集。我们进一步观察PILRα-/-对肾脏巨噬细胞等炎症细胞的募集，对炎症因子和趋化因子表达的影响。发现该基因敲除可促进机体炎症细胞的浸润和IL-12，IFN-γ，MCP-1，IL-6，IL-1β，TNF-α等炎症因子的释放。通过免疫组化评估WT小鼠的纤维化模型中不同时间点的纤维化程度，结果提示纤维化程度和间质损失随时间加剧，M2巨噬细胞可能逐渐增多，值得注意的是PILRα的表达量也逐步增多，考虑与炎症加重时，PILRα为抑制过强的炎症也增加其表达量以对抗炎症，发挥负调控的作用。PILRα可对中性粒细胞的浸润其负向调控作用。我们进一步将中性粒细胞消耗后可减轻肾功能进展，并减少淋巴细胞及巨噬细胞等的浸润。体外细胞实验评估PILRα对单核巨噬细胞粘附和迁移的调控作用。通过转染PILRα高表达及低表达质粒，发现上调PILRα可通过抑制β2整合素降低巨噬细胞的粘附和迁移能力，以及抑制巨噬细胞的促纤维化性能。为探讨PILRα对巨噬细胞极性的调节，检测两组造模小鼠肾脏组织中巨噬细胞分型的标志，提示PILRα可促进M2c的表型转换。另外，我们在研究中发现，PILRα-/-组的不对称二甲基化精氨酸(ADMA)明显升高，外源性输注ADMA可加重肾脏纤维化的发生，并抑制PILRα的表达，ADMA可能阻断PILRα与配体的结合加速肾脏纤维化的发生。为研究ADMA的清除，我们也在终末期肾病患者中探讨了ADMA的清除行为，发现ADMA可存储于体内的红细胞中不断释放。本项目的研究成果有望为肾脏纤维化的治疗提供新的科学理论依据和治疗靶点。