继发性人类NK细胞靶向转移所介导的恶性肿瘤免疫治疗

NK细胞移植不被受体排斥、不诱发GVHD且能产生良好的抗肿瘤反应，所以继发性NK细胞治疗已成为当前最热门和最有希望的恶性肿瘤治疗方法之一。但是由于NK细胞分离数目、NK细胞移植后体内活性维持以及NK细胞肿瘤浸润等方面因素的影响，NK细胞治疗的广泛临床应用被限制。本项目将用人工抗原递呈细胞从外周血白细胞中直接大量扩增高纯度的人类NK细胞，并对其自身用人类IL2、IL12、IL15、IL21和靶向性多肽分子 mRNA进行修饰或通过骨胳肌细胞mRNA电穿孔进行诱导，使移植后的NK细胞保持高活性，并在肿瘤部位高效靶向性富集与增殖，以突破目前的NK细胞治疗应用局限，实现NK细胞的体外高效扩增、体内高效靶向和高效杀伤，为继发性人类NK细胞转移在恶性肿瘤治疗中的早日常规临床应用提供可靠的理论依据与实验支撑。

过继NK细胞免疫治疗是一种极富前景的恶性肿瘤治疗新方法。然而由于NK细胞只是外周血单核细胞（PBMC）的一个很小群体（10~15%），难以满足巨大的临床需要；而且恶性肿瘤细胞具有免疫逃避特性，能够有效逃避NK细胞识别与杀伤。因此，要进行有效的NK细胞免疫治疗，首先必须在体外进行NK细胞的大规模扩增以满足临床需要，之后是提高NK细胞对肿瘤的识别与杀伤。为此，本项目中，我们首先构建了一种膜固定IL-21（mIL-21）和CD137L高表达的基因工程细胞，然后以该基因工程细胞为饲养细胞，从PBMC中进行NK细胞特异性扩增。通过研究我们发现，扩增2周之后，NK细胞纯度(CD3-CD56+/CD16+)达85%；3周之后，NK细胞纯度达95%以上；除NKp80外，所有检测的NK细胞激活受体与抑制受体表达都在扩增NK细胞中显著增加；NK细胞肿瘤杀伤活性显著增强。进一步的分子机理研究我们发现，NK细胞的高效扩增依赖于STAT3的激活，STAT3拮抗能够显著抑制NK细胞的扩增和杀伤活性。为提高过继转移NK细胞的识别与杀伤，我们分别构建了肿瘤靶向RGD-4C和CNGRC融合表达的IL-21表达载体，以在肿瘤组织内激活和扩增NK细胞。体外研究表明， RGD-4C和CNGRC与IL-21融合后不影响IL-21的表达及其对NK细胞的调节；然而体内试验却发现IL-21与过继NK细胞转移无协同抗肿瘤效应，这一意外发现对IL-21的临床应用具有重要指导作用。总之，本项目建立了具有完全自主知识产权的人类NK细胞体外扩增体系，并阐明了其相关机理；这一技术体系的建立为过继NK细胞免疫治疗在我国的开展提供了重要技术保障，具有良好的临床转化和应用前景。