Cortactin/actin介导幽门螺杆菌VacA转运至线粒体的机制研究

幽门螺杆菌（H.pylori）感染导致细胞凋亡异常与胃癌发生密切相关，H.pylrori主要致病因子空泡细胞毒素（VacA）靶向线粒体，导致线粒体依赖的细胞凋亡，但其转运至线粒体的分子机制尚不明确。研究显示，肌动蛋白（actin）与病原体的胞内运动密切相关，皮动蛋白（cortactin）既是actin动态组装的重要分子，又在细胞运动的信号转导中起着枢纽作用，actin对于VacA在内噬体之间的转运及亚细胞定位至关重要。因此本项目提出"VacA以actin依赖的方式通过初级内噬体转运至线粒体发挥致凋亡的作用，该通路与cortactin的调控密切相关"这一设想，拟通过观察VacA在细胞内的迁移和亚细胞定位，明确VacA转运至线粒体的通路，然后证实actin在这一通路中的作用，最后明确cortactin对该通路的调控及分子机制。希望为VacA致线粒体-凋亡的机理提供新的科学依据。

幽门螺杆菌（H.pylori）感染导致细胞凋亡异常与胃癌发生密切相关，H.pylori主要致病因子空泡细胞毒素（VacA）靶向线粒体，导致线粒体依赖的细胞凋亡，但其转运至线粒体的分子机制尚不明确。研究显示，肌动蛋白（actin）与病原体的胞内运动密切相关，皮动蛋白（cortactin）既是actin动态组装的重要分子，又在细胞运动的信号转导中起着枢纽作用。我们设想“VacA以actin依赖的方式转运至线粒体发挥致凋亡的作用，该通路与cortactin的调控密切相关”。 首先，我们采用硫酸铵沉淀法、构建pQE30- vacA载体等方法获得获得天然VacA蛋白、重组VacA蛋白以及粗纯蛋白，通过观察其生物学效应，发现三种蛋白均有致空泡效应，但只有天然的VacA蛋白具备致凋亡效应。第二，通过免疫荧光观察到VacA在细胞内的迁移和亚细胞定位，发现VacA从内噬体转移至线粒体。第三，构建cortactin慢病毒载体并筛选稳转AGS细胞株，采用qRT-PCR检测Cortactin在AGS细胞中的表达。随后通过流式细胞检测发现AGS/cortactin 细胞凋亡明显增加，AGS/cortactin shRNA细胞凋亡率无明显改变，cortactin 表达增加使细胞对VacA诱发的凋亡更敏感。Bax能增加AGS/cortactin 细胞凋亡率，而cortactin shRNA干扰了Bax的应答，cortactin 的缺失引起Bcl-2表达增加。提示cortactin 通过调节Bax 和Bcl-2 水平影响VacA 的功能。第四，探讨H.pylori 感染相关胃炎程度与胃粘膜细胞凋亡基因表达的相关性。qRT-PCR结果显示H.pylori感染胃黏膜中Bax的表达显著高于H.pylori未感染胃黏膜。在重度胃窦胃炎中，H.pylori感染胃黏膜中Bcl-2的表达显著低于H.pylori未感染胃粘膜。Bak的表达无明显改变。 Person相关分析表明Bax的表达与胃炎严重程度成正相关，而Bak和Bcl-2的表达与胃炎严重程度无明显相关。综上所述，VacA以actin依赖的方式从内噬体转运至线粒体，引起线粒体依赖的凋亡；cortacin通过调节Bax 和Bcl-2 水平影响VacA 的功能。