富组氨酸蛋白Hpn与细胞骨架蛋白actin的互作及其在幽门螺杆菌致病机制中的作用

Helicobacter pylori colonizes on the gastric epithelial cells and induces various kinds of gastric diseases including B-type gastritis, ulcer and cancer. This bacterium synthesizes a small histidine-rich protein Hpn accouting for up to 2 percent of total proteins synthesized. The previous work by our group indicates that this protein is an important nickel storage amyloid protein in Helicobacter pylori. Actin is one important cellular skeleton protein and is also involved in cellular secretion, cytosis and migration. Amyloid protein tau interacts with F-actin and in turn affect cellular skeleton and finally induces nerve damage. This project is focused on the interaction between the amyloid protein Hpn with.actin with various biophysical methods such as Fluorescence, UV, ITC and stopped flow. Supplemented with amino acid mutation and NMR, the key amino acids involved in protein-protein interaction are identified and verified. On the cell level, protein-protein colocalization and the effects on the cellular skeleton as well as the response from the gastric epithelial cells are investigated. The study will provide important clues for the pathological mechanisms of Helicobacter pylori.

幽门螺杆菌是一种寄生在胃粘膜上并能引发B型胃炎、溃疡以及胃癌的革兰氏阴性菌。该细菌合成了一种在细胞内占蛋白总量2%的富含组氨酸的小分子量蛋白质Hpn，我们课题组过去的研究工作发现该蛋白是幽门螺杆菌中一种重要的镍储运蛋白，部分被幽门螺杆菌分泌到体外，生成淀粉样纤维丝，是一种重要的毒理因子。Actin是真核细胞中一种重要的骨架蛋白，同时参与细胞分泌、吞噬、移动等过程，淀粉样蛋白tau通过与F-actin互作，影响到细胞骨架形态并且引起神经损伤。本研究课题着眼于利用荧光、紫外、ITC、停留等手段，研究幽门螺杆菌中淀粉样蛋白Hpn与actin互作的动力学与热力学，结合定点突变技术和核磁共振技术等研究关键氨基酸残基的作用；从细胞层面研究蛋白质之间的共定位，以及这种相互作用对细胞骨架及细胞的应激反应的影响，从而为幽门螺杆菌的致病机理研究提供重要线索。

幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性菌，它会导致慢性胃炎、胃溃疡和胃癌。Hpn是幽门螺杆菌合成的一种富组氨酸小蛋白，占细菌总蛋白的2%左右。肌动蛋白actin是细胞内一种重要的蛋白。利用交联实验反应，证实了Hpn与actin混合后会在50kDa大小左右产生一个二者的混合物。说明Hpn和actin可能以1:1的比例结合。溶解于G buffer内的actin是以单体的形式存在的，透射电镜结果显示，氯化钾处理后的actin会聚集成纤维状，同时，Hpn单体与actin混合后，actin也出现了聚集的情况。在电镜下观察，actin在KCl存在的环境中形成的多聚体和在Hpn存在的环境中形成的多聚体形状无明显差别，均呈纤维状。Hpn蛋白处理SGC-7901细胞，细胞活性也随之下降。转染过Hpn的SGC-7901细胞活性要低于对照组和转染pcDNA3.1的空载组。同时，通过细胞计数统计，发现转染Hpn后的细胞在48小时后的总数要小于对照组和转染pcDNA3.1的空载组。克隆形成实验表明，转染Hpn蛋白后的SGC-7901细胞形成的细胞克隆数要明显少于对照组与转染pcDNA3.1空载组细胞。伤痕愈合实验表明，一定浓度Hpn处理细胞后，细胞的迁移速度比未处理的对照组细胞要慢。为了验证Hpn对细胞的毒性，用不同浓度的Hpn蛋白处理SGC-7901细胞系，同时转染Hpn进入到细胞中。分别经过48小时后，显微镜下观察细胞的形态变化。结果显示，Hpn处理后，一些细胞出现了细胞膜破裂的现象，并释放细胞内含物到培养基中。而较低浓度Hpn处理细胞、转染Hpn的细胞和未处理的对照组细胞形态上并未有明显变化。用DAPI将细胞核染色，发现高浓度Hpn(10μM)处理后，完整的细胞核数量较转染Hpn的细胞、较低浓度Hpn处理的细胞和对照组细胞要少。并且，部分细胞核会破裂降解，变成更小的丝絮状物。综上所述，本课题阐述了Hpn与actin的相互作用，并且会影响胃上皮细胞系SGC-7901的活性、迁移和细胞膜的完整性。这为幽门螺杆菌是如何侵袭胃部的提供了一种新的构想，推动了对幽门螺杆菌致病性的深入研究，对进一步战胜这个病原体提供了新的思路。