类病毒颗粒组合层析一体化介质的制备与性能研究

Virus-like particles (referred to as VLP) have been playing a significant role in vaccines, gene or live cell therapy. As one of the main methods for virus-like particles purification, multistep chromatographic techniques have a series of problems in the application, e.g., protein inactivation, low purity and a long operation cycle, etc. In this project, a novel VLP-site directed binding chromatographic adsorbent with a high velocity and mulitiple functions is prepared and applied. Mix-mode ligands with an efficient binding to VLP are coupled onto high velocity agarose microspheres via spacer arms. The structure of the adsorbent is controllable by optimizing the kinds of ligand and its densities, the length of spacer arms and the crosslinking degree of matrix. Using HBsAg as model protein, the interaction mechanism between VLP and the adsorbent is studied, and the effects of the adsorbent's structure and the solution enviroment on the changes in protein structures are evaluated. Using the novel adsorbent, the problems of complex chromatographic steps, protein inactivation and low flow rate are well solved, and VLP purification in one step is achieved. The study presents a new idea and method for VLP and chromatography.

类病毒颗粒在疫苗、基因或细胞治疗等方面发挥着重大作用。作为类病毒颗粒主要纯化手段之一，组合层析技术目前存在层析步骤多、蛋白易失活、纯度低及操作周期长等问题，尚未见到将组合层析集为一体的报道。本项目提出构建一种集多种层析机理于一身的新型类病毒颗粒定点结合高流速层析介质，以高流速琼脂糖微球为基质，通过引入一定长度的手臂偶联对类病毒颗粒具有高效结合力的混合模式配基，通过调控配基种类和密度、手臂长度和基质交联程度，实现介质结构可控。以乙肝疫苗为对象，深入研究介质与类病毒颗粒的作用机理，探索介质表面结构与溶液环境对类病毒颗粒结构的影响机制。该介质突破传统纯化方法层析步骤多、蛋白易失活及操作流速慢的局限，在缩短层析步骤、提高操作流速的同时，达到特异性纯化的目的，实现类病毒颗粒组合层析一体化，为类病毒颗粒和色谱学发展提供新思路和新方法。

以类病毒颗粒为代表的复杂生物大分子在纯化过程中存在结构易发生变化、易失活等问题，严重制约生物及相关领域发展。现有层析介质结构单一、对目标蛋白特异性差以及操作流速慢是引起上述问题的主要原因。基于此，本项目开展类病毒颗粒组合层析一体化介质的制备与应用研究。通过向琼脂糖溶液引入一端惰性、一端活性的双功能团活化试剂，制得改性琼脂糖溶液，依次经过成球和交联等工艺，制备高流速琼脂糖微球，其最大线速度超过3000 cm/h，最大流速较常规介质增加两倍以上，并建立高流速基质的制备工艺与结构调控机制。以高流速琼脂糖微球为基质，引入一定长度的手臂，调节手臂长度和密度，偶联高亲和力配基，制备高流速、高结合力层析介质。引入线性手臂后，介质比表面积大大增加，介质结合蛋白能力显著提升，动态载量较常规介质提升20-40%以上，同时介质耐压能力得到明显改善，在此基础上建立高结合力介质的制备与结构调控机制。分别以乙肝表面抗原、抗体和酶等为模型蛋白，通过调控介质结构如配基密度、手臂长度等，考察其对目标蛋白载量、活性和纯度等的影响。其中，间臂在一定程度上增大介质与目标蛋白的结合能力，但间臂过长不利于蛋白活性保持，蛋白纯度也相应下降。评价介质稳定性和再生后性能，证实介质具有良好的稳定性和再生性质。讨论介质表面性质与溶液环境对目标蛋白结构的影响，高流速下该介质仍能保持很高的蛋白结合能力。研究介质结合蛋白的动力学与热力学过程，揭示介质与蛋白作用机理。该介质具有更大的比表面积以促进蛋白结合，在与蛋白发生静态结合作用过程中，介质具有更大的吸附热，证实介质吸附蛋白的过程是由熵驱动的结合过程。最终实现类病毒颗粒等复杂生物大分子的高通量纯化，为其他复杂生物大分子纯化提供借鉴。项目执行期间，以第一作者、通讯作者等发表国外SCI期刊论文6篇，国内期刊论文3篇。申请中国专利3项。参加国际学术会议2次。获中国分析测试协会科学技术奖青年奖1项。