分离鱼类GABA受体及其农药安全性靶标研究

课题针对氟虫腈对鱼类高毒性问题，研究鱼类GABA受体分离方法，培养GABA受体晶体，分析受体的结构与功能，确定配体与受体作用方式，阐明提高农药对鱼类安全性的分子作用机理，建立GABA受体抑制剂的鱼毒体外筛选方法。选择Ro7-1986（经典配体）和Fipronil为配体，连接在琼脂糖上制备亲和柱，通过亲和色谱、离子色谱，纯化和富集获得GABA受体蛋白，建立高纯度、高收率的靶标分离方法。接枝Fipronil和荧光标记物RB200到水溶性聚合物上，作为荧光探针，并与氟谱联合，鉴定Fipronil相关受体亚基，测定氨基酸序列，制备配体受体复合物。利用荧光分光光度法，建立新的GABA受体与配体的结合常数分析方法。透析法培养复合物晶体，X光谱分析晶体学基础数据，确定配体受体相互作用位置。采用计算机模拟技术分析鱼类与昆虫的GABA受体与配体相互作用的结构差异，为合成绿色农药提供理论指导。

本项目旨在分离鱼类 GABA 受体蛋白并研究其与农药小分子的相互作用，从而进一步解释该靶标蛋白与杀虫剂的相互作用机理，为新农药的合成提供理论依据。针对这一目标首先制备了Ro7-1986及氟虫腈亲和柱，然后用亲和柱分离鱼类GABA受体，并成功分离纯化了鳙鱼GABA受体。此外以Ro7-1986、氟虫腈(Fipronil)和异硫氰酸荧光素(FITC)为原料合成了两种 GABA受体的配体荧光探针。采用荧光标记法及计算机模拟法研究了Fipronil与鱼脑内GABA受体的相互作用，阐明了氟虫腈对鱼类高毒性的机理。. 本研究的研究结论如下：1）采用了荧光标记法测定蛋白大分子与农药小分子的亲和常数。研究结果表明，Ro7-1986和氟虫腈与受体的亲和常数Kd分别为67±5nM和346±6nM，最大结合量[RT]值分别为13.8±1.8 pmol/mg protein和40.6±3.5 pmol/mg protein。2）采用同源建模的方法构建了斑马鱼γ-氨基丁酸A型(GABAA)受体和果蝇RDL(resistance to dieldrin)受体跨膜区的三维结构，研究了氟虫腈在两个受体中作用位点的差异；采用分子对接和分子动力学方法，探讨了氟虫腈与斑马鱼GABAA受体和果蝇RDL受体的结合模式，并比较了氟虫腈与两个受体作用的差异性。结果表明：斑马鱼GABAA受体和氟虫腈作用位点的结构与果蝇RDL受体和氟虫腈作用位点的结构存在一定的差异，果蝇RDL受体的Ala301对应斑马鱼GABAA受体α1亚基的Val284和γ2亚基的Ser306，氨基酸构象的差异较大；氟虫腈与斑马鱼GABAA受体的结合位点靠近胞内区一端，而与果蝇RDL受体的结合位点则位于受体第二跨膜区的Ala301~Leu308区域内。复合物分子动力学模拟结果表明，在模拟过程中，两个受体与氟虫腈复合物体系的势能很快达到平衡状态。斑马鱼GABAA受体与氟虫腈之间形成4个氢键，其中概率大于60%的氢键有2个；而果蝇RDL受体与氟虫腈形成了6个氢键，但只有1个氢键的概率大于50%，其复合物结合的稳定性比前者低。