恶臭假单胞菌扁桃酸消旋酶催化底物多样性产生机制的研究

消旋酶在手性药物制备中的应用前景十分广阔。但是，由于消旋酶种类较少且大多数催化底物类型单一，所以它们的应用受到了极大地限制。理论上分子改造手段可以有效地提高消旋酶的催化底物多样性，拓展其应用空间。然而目前消旋酶的催化底物多样性的产生机制仍不清楚，因此很难开展相关分子改造工作。对此，本项目将通过对恶臭假单胞菌扁桃酸消旋酶的分子改造和结构分析，深入地研究其催化底物多样性产生和变化的分子机制及结构基础。首先，通过分子对接模拟技术对扁桃酸消旋酶突变体进行虚拟筛选，了解关键位点各种氨基酸分子性质与酶催化底物多样性的关系；然后，通过定点突变技术对筛选所得的突变体进行构建；最后，结合X射线单晶衍射的方法对所构建的突变体进行结构解析，从而系统地阐述扁桃酸消旋酶催化底物多样性的产生机制，最终获得可催化多种底物的消旋酶制剂，并实现更多手性化合物的动态动力学拆分。该工作将为消旋酶的分子改造打下良好的理论基础。

目前在手性化合物的制备中，通过特异性催化单一构型对映体，从而对外消旋体进行动力学拆分的方法有着相当广泛的应用。由于消旋酶能够催化单一手性构型对映体使其转化为外消旋体，可以在拆分的同时将非目标对映体不断转化为目标对映体，使拆分和外消旋化同时进行，从而获得100%的理论转化率。采用消旋酶与拆分酶联用进行酶法动态动力学拆分具有化学法无法比拟的优势,例如催化条件温和，不存在副反应，且由于酶催化条件之间的相似性，可以最大限度地保证反应效率并简化生产流程。因此，消旋酶在手性药物制备中的应用前景十分广阔。但是，目前具有工业应用价值的消旋酶种类仍然较少，并且多数酶具有很强的底物专一性，极大地限制了其在工业生产中的应用。因此如何扩展消旋酶的种类和来源以满足各类手性化合物生产的需要，具有重要的意义和价值。本项目以研究恶臭假单胞菌扁桃酸消旋酶的催化底物多样性产生机制为目标，通过分子对接模拟、突变体的虚拟筛选以及定点突变等手段，对扁桃酸消旋酶进行了分子改造，获得了具有高催化底物多样性的酶突变，并在此基础上对酶催化底物多样性产生和变化的分子机制进行了深入的分析。首先，利用分子动力学模拟以及MM-PBSA分析，对扁桃酸消旋酶的催化机理进行了探讨，发现残基S139通过氢键作用对稳定酶-底物复合物起作用。随后，在对消旋酶催化机制的理解基础上，以底物结合口袋氨基酸为对象，间氯扁桃酸为模式底物，酶-底物过渡态结合自由能为筛选标准，建立了消旋酶计算设计模型，并成功地指导了扁桃酸消旋酶的理性设计，将其对间氯扁桃酸等4种非天然底物的催化能力提高了2-5倍。然后，在通过理性设计将酯酶BioH对S-邻氯扁桃酸甲酯的对映体选择性提高了约50倍之后，将改造后的扁桃酸消旋酶和酯酶BioH双酶偶联用于动态动力学拆分制备氯吡格雷药物中间体——R-邻氯扁桃酸甲酯，最终R-邻氯扁桃酸甲酯的产率收率达到80%，ee值高于97%，基本实现了R-邻氯扁桃酸甲酯的酶法动态动力学拆分制备。本研究为扁桃酸消旋酶在手性化合物制备中的应用奠定了基础，并为消旋酶的分子改造提供了理论依据，从而推动更加高效、环保的动态动力学拆分工艺在手性化合物制备中的大规模应用。